活性氧對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞不同鉀通道離子電流的影響

1、    活性氧對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞不同鉀通道離子電流的影響?        摘要目的：揭示氧自由基導(dǎo)致跨膜電位變化的離子電流基礎(chǔ)。方法：采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，觀察了H2O2(lmmol/L)對(duì)豚鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞不同鉀通道的影響。結(jié)果：H2O2使豚鼠心肌細(xì)胞靜息電位(RP)降低，動(dòng)作電位時(shí)程(APD)顯著縮短的同時(shí)，明顯抑制超極化時(shí)的內(nèi)向整流鉀電流(IK1)，致(IK1)正常呈N字型I-V曲線幾乎變成一條斜線；增強(qiáng)延遲整流鉀電流(IK)的快組分(IKr)和慢組分(IKs)，尤其IK

2、r增加更顯著，并使電流電壓曲線向右上偏移。結(jié)論：氧自由基對(duì)心室肌細(xì)胞的IK1和IK的不同影響，是其所致跨膜電位變化和心律失常的可能離子機(jī)制。主題詞過(guò)氧化氫；豚鼠；心??；離子通道；心律失常 Effect of H2O2 on different potassium channel ionic currentsof ventricular myocytes of guinea pigXU Chang-Qing, LI Yu-Rong, SUN Ke-Qing, YANG Bao-Feng,SAN Hong-Li, LOU Yan-Ping, FU Guo-HuiDepartment of Path

3、ophysiology, Physiology, Pharmacology, Harbin Medical University, Harbin (150086)Abstract AIM: To reveal ionic current basis of the change of transmembrane potential induced by oxygen free radical. METHOD：The whole cell recording patch clamp technique was used to investigate the effect of H2O2 (1 mm

4、ol/L) on different potassium channel ionic currents of ventricular myocytes of guinea pig. RESULTS：It was found that H2O2reduced rest potential (RP) and shortened action potential duration (APD) significantly, inhibited the inward rectifier K current (IK1) markedly. H2O2 changed the current-voltage

5、(I-V) relation to IK1 from a N shape to a /shape and enhanced the rapid component (IKr) and the slow component (IKs) of the delayed outward retifier K current (IK), especially IKr, and made IK I-V curve shift to up-right. CONCLUSION：Different effects of oxygen free radical on IK1 and IK of ventricul

6、ar myocytes is a possible ionic mechanism for the change of transmembrane potential and arrhythmia induced by oxygen free redical. MeSHHydrogen peroxide; Guinea pigs; Myocardium; Ion channels; Arrhythmia氧自由基參與了細(xì)胞內(nèi)鈣超載和再灌注心律失常的發(fā)生1，其確切機(jī)制尚有待深入研究。H2O2作為外源性羥自由基的生成系統(tǒng)，廣泛用于氧自由基對(duì)單個(gè)心肌細(xì)胞電生理活動(dòng)影響的探討。無(wú)論常規(guī)微電極和膜片鉗技術(shù)

7、之間，還是采用同種方法的不同實(shí)驗(yàn)室之間，得出的結(jié)論不盡相同，有的甚至截然相反24。為了進(jìn)一步明確有關(guān)問(wèn)題，我們觀察了H2O2對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞不同鉀通道離子電流的影響，并分析了其與動(dòng)作電位的關(guān)系。材料與方法(一)單個(gè)心室肌細(xì)胞的分離：實(shí)驗(yàn)用豚鼠，由本校動(dòng)物中心提供，體重(312±23) g,雌雄不拘。分離方法及條件與先前報(bào)道基本相同5。即將豚鼠擊頭致昏后，迅速開胸取心，主動(dòng)脈插管，使用Langendorff灌流裝置，經(jīng)冠狀動(dòng)脈首先灌注正常臺(tái)氏液(mmol/L:NaCl 116,NaH2PO4 1.4，KCl 5.4，NaHCO3 15,MgSO4 1,CaCl2 1.8和glucose

8、 15)沖出積血，接著灌注無(wú)鈣臺(tái)氏液45 min使心臟停跳，最后用含有型膠原酶(0.2500.375 g/L)的低鈣臺(tái)氏液(150mol/L)反復(fù)消化4060 min,灌流速度為78 mL/min。所有的液體均用95%O2+5%CO2飽和，溫度為(37±0.5) 。在不同時(shí)間間隔分別于心尖部位連續(xù)剪取心肌組織。將消化好的心室肌進(jìn)行吹打，振蕩，加含白蛋白(0.5 mg/mL) KB溶液保存?zhèn)溆谩Ｓ迷摲ǚ蛛x心肌細(xì)胞，由于細(xì)胞取自不同的消化時(shí)間，總有一個(gè)或幾個(gè)時(shí)段的細(xì)胞消化分離“恰到好處”，故每次都能獲得60%80%的橫紋清晰、質(zhì)膜完整、呈桿狀的耐鈣心室肌細(xì)胞，且容易封接。(二)膜電流和膜

9、電位的記錄：將分離的單個(gè)豚鼠心室肌細(xì)胞放入倒置顯微鏡(OLYMPUSIMT-2)載物臺(tái)上的灌流槽中，灌流液體為改進(jìn)的臺(tái)氏液(NaCl 136,NaH2PO4 1.2,KCl 5.4,MgSO4 1.2,CaCl2 1.8,glucose 15和HEPES 5 mmol/L,pH用NaOH調(diào)至7.3)，灌流速度為1.01.5 mL/min。上述操作在室溫下(25±1) 進(jìn)行。使用膜片鉗放大器(AxoPATCH200A)、數(shù)模轉(zhuǎn)換系統(tǒng)(DigiData 1200)和pCLAMP 6.02微機(jī)程序，全細(xì)胞式記錄方法，用電流鉗檢測(cè)單細(xì)胞跨膜電位，同時(shí)用電壓鉗檢測(cè)內(nèi)向整流鉀電流(inward

10、rectifier potassium current,IK1)和延遲整流鉀電流(delayed outward potassium current,IK)，動(dòng)態(tài)采樣、儲(chǔ)存和分析5。IK1和IK為電壓依賴性鉀電流，其刺激程序見后面1和3。用兩步拉制器(NARISHIGE)將硬質(zhì)玻璃毛細(xì)管(內(nèi)徑小于 4m)拉制成微管電極，其尖端直徑約24 m，電阻為3.36.2 M，內(nèi)含細(xì)胞內(nèi)液成分：K-aspartate 125; KCl 20; EGTA 10; HEPES 5; MgCl2 10； ATP-Na 5 mmol/L; pH用KOH調(diào)至7.2。(三)藥物和試劑：膠原酶、維拉帕米、天門冬氨酸鉀、

11、HEPES、白蛋白等由Sigma Co. 生產(chǎn)。余為分析純。(四)實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組(加藥前)、H2O2(1 mmol/L)實(shí)驗(yàn)組和沖洗后恢復(fù)組。所有觀察指標(biāo)均在同一細(xì)胞內(nèi)完成，系處理前后對(duì)照。在各種處置作用812 min采集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。(五)資料分析：數(shù)據(jù)以±s表示，用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行均數(shù)差異顯著性測(cè)定。結(jié)果一、H2O2對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞跨膜電位的影響：本實(shí)驗(yàn)采用的H2O2(1 mmol/L)，引起豚鼠心室肌細(xì)胞靜息電位(rest potential, RP)明顯降低(P0.05)，動(dòng)作電位時(shí)程(action potential duration, APD)顯著縮短(P0.01

12、)，但對(duì)動(dòng)作電位幅度(action potential amplitude, APA)和超射(overshoot, OS)均無(wú)明顯影響(見表1)。表1H2O2(1 mmol/L)對(duì)豚鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞跨膜電位的影響Tab 1 Effect of H2O2 (1 mmol/L) on the transmembrane potential in guinea pig ventricular myocytes (±s, n=8)RP(mV)APA(mV)OS(mV)APD50(ms)APD90(ms)Control-73.0±9.8112.0±16.038.9±

13、;7.0409.0±233.4515.0±234.0H2O2-65.3±11.3*107.9±15.242.7±6.2169.5±176.0*238.4±210.3?     *P0.05, *P0.01, vs control二、H2O2(1 mmol/L)對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)向整流鉀電流(IK1)的影響：H2O2(1 mmol/L)明顯抑制IK1，尤其在超極化時(shí)更是如此。例如，指令電位為-120 mV和-110 mV時(shí)，IK1由對(duì)照組的(-2133.5±570.4) pA和

14、(-1671.3±469.0) pA分別降低到(-567.0±218.0) mV和(-490.0±169.0) mV(n=8, P0.01)。1為其中1次的實(shí)驗(yàn)記錄。     Fig 1 Effect of H2O2(1 mmol/L) on the inward rectifier K current (IK1) in guinea pig ventricular myocytes1H2O2(1 mmol/L) 對(duì)豚鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞IK1的影響     Fig 2 Effect of

15、 H2O2 (1 mmol/L) on the current-voltage (I-V) relation for IK1 in guinea pig ventricular myocytes2H2O2（1 mmol/L）對(duì)豚鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞IK1的電流-電壓曲線關(guān)系的影響在本實(shí)驗(yàn)條件下，正常對(duì)照組的IK1的I-V曲線呈N字型，與電壓軸線有3個(gè)交點(diǎn)，H2O2明顯抑制超極化時(shí)的內(nèi)向電流，取消了-10至+20 mV間的內(nèi)向電流，并使+20 mV以上的外向電流有所增強(qiáng)，致I-V曲線幾乎變化一條斜線(2)。三、H2O2(1 mmol/L)對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞延遲整流鉀電流(IK)的影響：H2O2(1 m

16、mol/L)可使IK增強(qiáng)，其中其快組分(IKr)增加顯著，而慢組分(IKs)增加不甚顯著。例如，在指令電位為40 mV時(shí)，IKr由(290.8±277.2) pA增強(qiáng)至(630.3±130.6) pA (n=6,P0.05),IKs由(826.2±215.8) pA增加至(1089.8±473.8) pA (n=6,P0.05)。3為其中1次的實(shí)驗(yàn)記錄。在本實(shí)驗(yàn)條件下，正常對(duì)照組的IKr具有內(nèi)向整流特點(diǎn)，其I-V曲線呈V字型，與電壓軸線有兩個(gè)交點(diǎn)(-10 mV,+20 mV)，H2O2明顯抑制IKr的內(nèi)向電流，增強(qiáng)外向電流，使I-V曲線向右上移位(4)。

17、正常IKs均為外向電流，I-V曲線呈/型，H2O2增強(qiáng)這種外向電流，使I-V曲線向右上移位(5)。     Fig 3 Effect of H2O2(1 mmol/L) on the delayed rectifier K current (IK) in guinea pig ventricular myocytes3H2O2(1 mmol/L) 對(duì)豚鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞IK的影響     Fig 4 Effect of H2O2 (1 mmol/L) on the current-voltage (I-V) rela

18、tion for IKr in guinea pig ventricular myocytes4H2O2（1 mmol/L）對(duì)豚鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞IKr的電流-電壓曲線關(guān)系的影響     Fig 5 Effect of H2O2 (1 mmol/L) on the current-voltage (I-V) relation for IKs in guinea pig ventricular myocytes5H2O2（1 mmol/L）對(duì)豚鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞IKs的電流-電壓曲線關(guān)系的影響討論本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)H2O2在使豚鼠心肌細(xì)胞RP降低和APD顯著縮短的同時(shí)

19、，明顯抑制IK1和增強(qiáng)IK。Satoh等采用全細(xì)胞電壓鉗方法，觀察到H2O2(100 mol/L)可抑制豚鼠心室肌細(xì)胞ICa和增強(qiáng)IK4。Haruaki Nakaya等觀察到異丙基苯過(guò)氧化氫(cumene hydroperoxide)顯著抑制豚鼠心室肌細(xì)胞IK16。這些與我們觀察到的情況相一致。我們?cè)谠缒臧l(fā)表的論文中，提出了APD10(復(fù)極達(dá)10%所需時(shí)間)相當(dāng)于復(fù)極1期(快速?gòu)?fù)極早期)，APD50-10(復(fù)極達(dá)50%所需時(shí)間與復(fù)極達(dá)10%所需時(shí)間之差)相當(dāng)于復(fù)極2期(平臺(tái)期，緩慢復(fù)極期)，APD90-50(復(fù)極達(dá)90%所需時(shí)間與復(fù)極達(dá)50%所需時(shí)間之差)相當(dāng)于復(fù)極3期(快速?gòu)?fù)極晚期)的看法7

20、。近來(lái)，通過(guò)將膜片鉗技術(shù)測(cè)得的藥物抑制L型鈣電流和縮短動(dòng)作電位時(shí)程效應(yīng)的資料進(jìn)行相關(guān)性分析，進(jìn)一步證實(shí)上述觀點(diǎn)的正確8。IK1主要負(fù)責(zé)維持心肌細(xì)胞的RP和動(dòng)作電位(AP)3期快速?gòu)?fù)極化過(guò)程，IK則參與整個(gè)復(fù)極過(guò)程，和ICa一起共同維持AP的平臺(tái)期9，10。IK1的抑制，必然導(dǎo)致RP降低和AP復(fù)極3期的延長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)中，H2O2引起的豚鼠心室肌細(xì)胞RP的降低(由-73.0±9.8 mV降至-65.3±11.3 mV)，APD90-50(復(fù)極3期)占整個(gè)APD的比例平均由18.9%增加到26.3%，顯然與H2O2顯著抑制IK1有關(guān)。H2O2引起的IK增強(qiáng)及ICa的抑制(資料另文報(bào)

21、道)，共同導(dǎo)致APD的顯著縮短。IK1減少應(yīng)導(dǎo)致APD延長(zhǎng)，IK增大則可導(dǎo)致APD縮短。APD究竟如何，取決于兩者作用大小。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步說(shuō)明IK是控制APD長(zhǎng)短的主要鉀通道離子電流。氧自由基與缺血時(shí)心功能障礙、缺血后心肌“頓挫”和再灌注損傷(包括再灌注性心律失常)有關(guān)，得到許多臨床觀察和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的證實(shí)14。H2O2屬于活性氧，它在體內(nèi)可轉(zhuǎn)變成細(xì)胞毒性極強(qiáng)的OH。人們可利用H2O2作為外源性自由基生成系統(tǒng)，觀察自由基對(duì)機(jī)體的影響。H2O2引起RP降低，使RP和閾電位距離變小，可使心肌興奮性增強(qiáng)；對(duì)背景鉀電流IK1的抑制，可導(dǎo)致心肌自律性增強(qiáng)；使APD縮短，必然使有效不應(yīng)期也相應(yīng)縮短。這些均可成為氧自由基引起心律失常的電生理機(jī)制。氧自由基對(duì)心肌細(xì)胞離子電流影響，各家報(bào)道不一。例如，內(nèi)向整流鉀電流(IK1)減小或不受影響