幾種三聚氰胺快速檢測方法比較概要

1、幾種三聚氰胺檢測方法比較2007年3月，美國發(fā)生多起因食用寵物食品而導(dǎo)致寵物中毒死亡事件。2008年9月,中國發(fā)生因食用三鹿嬰幼兒奶粉導(dǎo)致嬰幼兒產(chǎn)生腎結(jié)石病癥的 嚴(yán)重事件。兩起事件的原因都是在食品或飼料中非法添加大劑量三聚氰胺。因 此，如何快速準(zhǔn)確的分析食品和飼料中的三聚氰胺成為食品企業(yè)、食品管理機 構(gòu)和廣大消費者密切關(guān)注的問題。為科學(xué)合理地篩選快速、簡便、準(zhǔn)確、經(jīng)濟的三聚氰胺檢測方法，中國計量院提出搭建快速檢測方法測試平臺的建議，并承擔(dān)了科技部應(yīng)急支撐項目“三聚氰胺快速檢測技術(shù)測試平臺的建設(shè)”。該平臺啟動以來，以權(quán)威檢測技術(shù)為支撐，以盲樣測試結(jié)果為依據(jù)，開展技 術(shù)評價，在國內(nèi)首創(chuàng)“統(tǒng)一現(xiàn)場測

2、試、統(tǒng)一評價方案、統(tǒng)一判別依據(jù)、統(tǒng)一專家 評審、統(tǒng)一現(xiàn)場公布測試結(jié)果”的三聚氰胺檢測方法評價模式。以國際比對互認(rèn)為基礎(chǔ)，建立乳與乳制品中的三聚氰胺氣相色譜同位素稀釋質(zhì)譜法和液相色譜同 位素稀釋質(zhì)譜法，為評價快速檢測方法奠定了重要的技術(shù)基礎(chǔ)。為確保三聚氰胺檢測結(jié)果的有效性，全面提高檢測實驗室對原料乳及奶粉中 三聚氰胺檢測能力水平，測試平臺先后組織實施了 5輪全國三聚氰胺快速檢測技 術(shù)方法的現(xiàn)場統(tǒng)一測試評價活動，共測試評價了56種檢測技術(shù)或方法，有效推出液相色譜法、拉曼光譜法、膠體金試免疫層析法（膠體金速測卡法）、酶聯(lián)免 疫法（ELISA試劑盒法）4種三聚氰胺快速檢測方法。本文對常用的三種三聚氰胺

3、快速檢測方法：液相色譜法、酶聯(lián)免疫法和膠體金免疫層析法的原理、特點做簡單介紹并對其應(yīng)用進(jìn)行比較。1. 液相色譜法國家標(biāo)準(zhǔn)GB /T 22400 2008公布了原料乳中三聚氰胺快速檢測 的高效液相色譜法（HPLC法）,采用乙腈作為原料乳中的蛋白質(zhì)沉淀劑和三聚 氰胺提取劑,0. 2 um微孔濾膜過濾后供HPLC測定。采用的色譜柱為強陽 離子交換色譜柱，（10 mmo l/L 檸檬酸，10 mmo l/L辛烷磺酸鈉，調(diào)節(jié)pH至3.0 ）,采用紫外/二極管陣列檢測器檢測，定量限為0. 3mg /kg, 定量靈敏度提高，且分析時間較短。 HPLC法雖然應(yīng)用普遍,但存在一定的局限性,樣品前處理過程復(fù)雜,儀

4、器 昂貴,對檢測人員的要求高，檢測成本高。1.1 原理用乙腈作為原料乳中的蛋白質(zhì)沉淀劑和三聚氰胺提取劑，強陽離子交換色譜柱分離，高效液相色譜-紫外檢測器/二極管陣列檢測器檢測，外標(biāo)法定量。1.2 主要試劑和材料1.2.1 乙腈（CH3CN :色譜純。1.2.2 磷酸（H3PO4。1.2.3 磷酸二氫鉀（KH2P0）。1.2.4 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（C3H6N6 :純度大于或等于99%1.2.5 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液：1.00 X 103 mg/Lo1.3. 儀器1.3.1 液相色譜儀：配有紫外檢測器/二極管陣列檢測器。1.3.2 分析天平：感量0.0001 g 和0.01 go133 pH 計：

5、測量精度土 0.021.4 檢驗操作：按國標(biāo) GB /T 22400 2008要求操作。2. 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）酶聯(lián)免疫法（enzyme linkedimmunosorbent assay， ELISA）是在免疫熒光和組織化學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新技術(shù)。其主要是利用抗原與抗體的高特異 性反應(yīng)，通過合適的載體，使酶標(biāo)抗原或抗體與待測樣品反應(yīng)，形成酶標(biāo)抗原抗體復(fù)合物，在相應(yīng)的酶底物參與下，復(fù)合物上的酶催化底物使之水解成有色物質(zhì)。 一定條件下，呈色物質(zhì)與待測物的含量直接相關(guān)，因此可以根據(jù)呈色物質(zhì)顏色的 深淺，對待測樣品進(jìn)行定性定量分析。近幾十年，國內(nèi)外已建立了數(shù)十種藥物殘留的 ELISA分析技

6、術(shù)，檢測水平 可達(dá)ng甚至pg水平。一些發(fā)達(dá)國家已經(jīng)研制成商品化的檢測試劑盒用于快速 檢測。近十多年來我國也研發(fā)出多種商品化的檢測試劑盒用于快速檢測。酶聯(lián)免疫吸附法具有特異性高、靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡單、成本低，并可 同時對大批量樣品進(jìn)行快速檢測的特點，目前廣泛應(yīng)用于食品中獸藥、毒素檢測的初篩中。08年中國出現(xiàn)“三聚氰胺奶粉事件”時，主要使用的進(jìn)口三聚氰胺速測試劑盒，現(xiàn)在國內(nèi)也已研發(fā)出商品化的三聚氰胺速測試劑盒，試劑盒靈敏度0.01ppm,最低檢測限為0.1ppm,已廣泛用于快速檢測。2.1 原理采用間接競爭ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被三聚氰胺抗原，樣本殘留的三聚氰胺和微孔條上預(yù)

7、包被的抗原競爭抗三聚氰胺抗體，加入TMB底物顯色，樣本吸光值與其殘留物三聚氰胺成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍 數(shù)，即可得出樣本中三聚氰胺的含量。2.2 主要試劑、材料三聚氰胺ELISA檢測試劑盒2.3 儀器2.3.1 獸藥殘留分析儀或酶標(biāo)儀2.3.2 分析天平：感量0.01g2.4 檢驗操作：按三聚氰胺ELISA檢測試劑盒說明書要求操作。3. 膠體金免疫層析技術(shù)膠體金免疫層析技術(shù)（Colloidal Gold Immu no chromatographic Assay , GICA）是以膠體金為標(biāo) 記物的免疫層析技術(shù)，免疫層析（Immunochromatography, IC）技

8、術(shù)是20世紀(jì) 80年代發(fā)展起來的一種將免疫技術(shù)和色譜層析技術(shù)相結(jié)合的快速免疫分析方 法。其原理是以條狀纖維層析材料為固相，借助毛細(xì)作用使樣品溶液在層析條上 泳動,同時,使樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的受體 （如抗體或抗原） 發(fā)生高特異、高親和性的免疫反應(yīng)，層析過程中免疫復(fù)合物被富集或截留在層析 材料的一定區(qū)域（檢測帶），通過酶促顯色反應(yīng)或直接使用可目測的著色標(biāo)記物 （如膠體金），短時間（510min內(nèi)）便可得到直觀的實驗結(jié)果。膠體金免疫層析技術(shù)不需進(jìn)行結(jié)合標(biāo)記物與游離標(biāo)記物的分離，省去了繁瑣的加 樣、洗滌步驟。因而這種分析技術(shù)操作簡單快速，分析結(jié)果清楚，易于判斷,且無 須儀器。膠體金免

9、疫層析技術(shù)在醫(yī)學(xué)上應(yīng)用較多，在食品檢測領(lǐng)域的應(yīng)用在近幾年才發(fā)展 起來。國外在此方面起步較早，現(xiàn)在已經(jīng)有很多成熟的產(chǎn)品問世，國內(nèi)這幾年也發(fā) 展較快，有多種應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)的商業(yè)化產(chǎn)品面世， 三聚氰胺膠體金速 測卡就是其中之一0三聚氰胺膠體金速測卡檢測靈敏度高，結(jié)果直觀，操作方便、快捷，攜帶、儲存 方便，成本低，非常適合于基層執(zhí)法部門對三聚氰胺的快速篩查。3.1 原理三聚氰胺膠體金速測卡的檢測原理是競爭性免疫層析。將著色標(biāo)記物與待 測抗原的特異性抗體（Ab1）相偶聯(lián)，沉積在結(jié)合區(qū)。而檢測區(qū)處固相化的是待測抗 原或待測抗原的類似物。若樣品中含有待測抗原，則樣品中的抗原和帶有標(biāo)記物 的Ab1形成Ag-Ab1復(fù)合物。隨后在通過固相化有待測抗原或其類似物的檢測區(qū) 時，由于競爭抑制，不再發(fā)生反應(yīng)，檢測線處不顯色；樣品繼續(xù)前移,Ag- Ab1復(fù)合物被固相化在質(zhì)控線處的抗 Ab1抗體（Ab2）所結(jié)合,形成 Ab1- Ag- Ab2復(fù)合物,使質(zhì)控線顯色。3.2主要試劑、材料三聚氰胺膠體金速測卡3.3檢驗操作：按三聚氰胺膠體金速測卡說明書要求操作。4.三種三聚氰胺快速檢測方法的比較方法液相色譜法酶聯(lián)免疫吸附法膠體金免疫層析法儀器液相色譜儀獸藥殘留分析儀/酶標(biāo)儀試劑（盒）色譜純試劑ELISA檢測試劑盒膠體金速測卡定性、定量定性、定量定性、半定量檢測靈敏度0.05ppm0.1ppm0.1ppm樣