【精品論文】膠原蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選及酶的分離純化

1、生物工程學(xué)報 Chin J Biotech 2010, February 25; 26(2): 194200 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb ©2010 CJB, All rights reserved.膠原蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選及酶的分離純化劉麗莉1,2，馬美湖1，余秀芳1，王文濤11 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，武漢 4300702 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，洛陽 471003摘 要: 從堆積骨骼的土樣中篩選出高產(chǎn)膠原蛋白酶的MBL13菌株，經(jīng)鑒定為蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus。對其所產(chǎn)的膠原蛋

2、白酶BCC進(jìn)行分離純化，并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的研究。從菌株的發(fā)酵液中純化出分子量約為38.0 kDa BCC酶。酶反應(yīng)的最適溫度為40，最適pH為8.0。在50以下穩(wěn)定，60保溫1 h酶活僅保留10；在pH 7.08.5活性較穩(wěn)定；金屬離子Ca2+、Zn2+、Mg2+對酶有激活作用，金屬離子Cu2+對酶有顯著的抑制作用。EDTA和EGTA能抑制該酶，表明BCC酶為一種金屬蛋白酶。酶的底物特異性表明該酶為骨膠原蛋白酶，且對型骨膠原蛋白水解能力極顯著高于型膠原蛋白和型膠原蛋白。將純化的BCC酶應(yīng)用于骨膠原蛋白的水解可以得到不同鏈長的多肽，其水解能力高于標(biāo)準(zhǔn)品膠原酶型。本研究為工業(yè)酶提供了新的菌株和新型膠

3、原蛋白酶，為膠原蛋白酶的開發(fā)提供了重要的理論依據(jù)。 關(guān)鍵詞: 膠原蛋白酶，篩選，純化，性質(zhì)Screening of collagenase-producing strain andpurification of Bacillus cereus collagenaseLili Liu1,2, Meihu Ma1, Xiufang Yu1, and Wentao Wang11 College of Food Science & Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China2 School of Food

4、& Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, ChinaAbstract: We isolated the strain MBL13 with high collagenase productivity from the soil of piled up animal bones. It was identified as Bacillus cereus. We purified and characterized Bacillus cereus collagenase (BC

5、C). The molecular weight of BCC was 38.0 kDa and the optimum temperature and pH for the enzyme activity were 40°C and 8.0 respectively. The enzyme was stable when the temperature was below 50°C, but only retained 10% activity when kept at 60°C for 1 h. The enzyme activity was stable b

6、etween pH 7.08.5. Some metal ions such as Ca2+, Zn2+, Mg2+ enhanced the enzyme activity, and Cu2+ brought the obvious inhibition. In addition, EDTA and EGTA could inhibit the enzyme activity. We suggested that the purified enzyme was a member of the metalloproteases. Based on the experiment of subst

7、rate specificity, we found that the purified enzyme was bone collagenolytic protease, and had a much stronger capacity of hydrolysis for type I collagen than that for type II collagen and type III collagen. By BCC hydrolyzing bone collagen, we obtained polypeptides with different chain lengths. The

8、comparative test indicated that the hydrolysis capacity of BBC was higher than that of standard type I collagenase. The results introduced a new strain and a novel collagenolytic protease for industrial enzyme.Received: August 17, 2009; Accepted: November 19, 2009Supported by: Key Projects in the Na

9、tional Science & Technology Pillar Program during the Eleventh Five-year Plan Period (No. 2006BAD05A17). Corresponding author: Meihu Ma. Tel: +86-27-87283177; Fax: +86-27-87283177; E-mail: mameihuhn劉麗莉等: 膠原蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選及酶的分離純化195Keywords: collagenase, screening, purification, property隨著我國養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展，屠宰所

10、產(chǎn)生的副產(chǎn)物是不可忽視的。骨骼是豐富的蛋白質(zhì)資源，主要成份是膠原蛋白，骨膠原蛋白是膠原蛋白的一種?，F(xiàn)今利用高新技術(shù)如酶技術(shù)對龐大的骨資源進(jìn)行深加工，開發(fā)新型的功能性骨膠原多肽具有十分重要的經(jīng)濟(jì)價值成為研究的熱點(diǎn)1-3。膠原蛋白酶的研究始于19世紀(jì)末。膠原蛋白酶(Collgaenolytci protease) 定義為在適當(dāng)?shù)膒H和溫度下，只切割活性膠原螺旋區(qū)或明膠而不作用于其他蛋白底物的酶類4-5。然而，只有為數(shù)有限的蛋白酶具有獨(dú)特的特點(diǎn)可以引起膠原蛋白的降解。膠原蛋白酶按照其來源可分為微生物膠原蛋白酶和動物膠原蛋白酶。細(xì)菌膠原酶可分泌到胞外，通過發(fā)酵可大量獲得，微生物來源的膠原酶在應(yīng)用方面具

11、有更廣的應(yīng)用范圍6。膠原蛋白酶在醫(yī)學(xué)上可用于治療異常增生，如腰椎間盤突出癥等疾病，也可在細(xì)胞研究中應(yīng)用于分離胃腸細(xì)胞、胰島素和上皮細(xì)胞等，還可應(yīng)用于膠原結(jié)構(gòu)、生物合成的研究等，具有重要的理論研究意義和應(yīng)用研究價值7。本實(shí)驗(yàn)從堆積骨骼的土樣中篩選出骨膠原蛋白的產(chǎn)生菌株，以探討應(yīng)用工業(yè)化發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)該酶的可能，篩選到的一株高產(chǎn)膠原蛋白酶的MBL13菌株。對其所產(chǎn)膠原蛋白酶BCC進(jìn)行了提純及性質(zhì)研究，以期為進(jìn)一步開發(fā)和利用新型的膠原蛋白酶提供科學(xué)依據(jù)。司。骨明膠，食品級。其他試劑均為分析純。 1.1.2 儀器與設(shè)備ZHWY-2102C型立式雙層恒溫?fù)u床 (上海智誠有限公司)；SW-CJ-2D型雙人

12、單面凈化工作臺 (蘇州凈化設(shè)備有限公司)；YM75 (Z) 不銹鋼立式電熱蒸汽消毒器 (上海三申醫(yī)療器械有限公司)；DYCZ-24DN型雙垂直電泳儀 (北京六一儀器廠)；HD-3000型核酸檢測儀、恒流泵、收集器 (上海嘉鵬科技有限公司)；超速冷凍離心機(jī) (Avanti J-E，Beckman coulter, USA) 等。 1.1.3 培養(yǎng)基富集培養(yǎng)基 (1000 mL)：骨明膠10 g，NaCl 5 g，蛋白胨5 g，pH 7.27.5。初篩培養(yǎng)基 (1000 mL)：骨明膠20 g，葡萄糖5 g，NaCl 0.1 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g

13、，pH 7.27.5。復(fù)篩培養(yǎng)基 (1000 mL)：葡萄糖 20 g，酵母粉1.5 g，骨明膠10 g，NaH2PO4·2H2O 0.5 g，K2HPO4·3H2O 2.5 g，CaC12 0.05 g，pH 7.07.28。固體培養(yǎng)基：在上述液體培養(yǎng)基中加入2.0瓊脂，即成相應(yīng)固體培養(yǎng)基。1.2 實(shí)驗(yàn)方法 1.2.1 培養(yǎng)方法斜面及平板培養(yǎng)：37恒溫培養(yǎng)48 h。復(fù)篩發(fā)酵培養(yǎng)：復(fù)篩培養(yǎng)基10 mL盛于50 mL三角瓶中，接種后在37，搖床180 r/min培養(yǎng)48 h。產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)：復(fù)篩培養(yǎng)基30 mL盛于250 mL三角瓶中，接種后37，搖床180 r/min培養(yǎng)48

14、 h。 1.2.2 BCC產(chǎn)生菌的篩選采集的土樣先經(jīng)富集培養(yǎng)48 h；稀釋涂布于初篩培養(yǎng)基的平板上形成單菌落，滴加酸性汞試劑在菌落周圍，選擇透明圈直徑與菌落之比較大的進(jìn)行復(fù)篩，并測定發(fā)酵液中膠原蛋白酶活力 (酸性汞試劑：HgCl2 15 g，濃HCl 20 mL，加蒸餾水至100 mL)。 1.2.3 BCC酶的分離純化將發(fā)酵液離心，取上清液得粗酶液，以硫酸銨分段鹽析得沉淀為A酶樣，將其溶解后并采用pH 7.5、20 mmol/L Tris-HCl緩沖液透析，然后過以同樣緩沖液平衡的DEAE-Cellulose-52柱并洗滌，然1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料 1.1.1 試劑酸性可溶性型膠原(

15、Acid-soluble typecollagen from calfbone) 和膠原酶型 (酶活大于125 U/mg) 購自Sigma公司。電泳所需的生化試劑為超純試劑，分別購自美國Simga公司和Flkua公司。DEAE- Cellulose-52、Sephadex G-100為Pharmacia 公司產(chǎn)品。低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白購自上海升正生物技術(shù)公司。細(xì)菌16S rDNA PCR擴(kuò)增試劑盒 (Code NO1310) 和切膠試劑盒 (Code NO1DV805A) 購自TaKaRa公196 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech February

16、 25, 2010 Vol.26 No.2后以0.10.5 mol/L NaCl和0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液進(jìn)行線形梯度洗脫，收集活性部分得酶樣B，濃縮后在Sephadex G-100柱上凝膠過濾，收集活性峰，冷凍干燥得純化的酶C制品。該純化BCC酶在分離膠濃度為15，SDS-PAGE電泳進(jìn)行純度分析，考馬斯亮藍(lán)法顯跡9-10。1.2.4 純化BCC的酶學(xué)性質(zhì)研究最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性：在不同溫度下按照標(biāo)準(zhǔn)方法測定酶活力，以酶活力最高者為100。酶液在10、20、30、37、50、60、70下分別保溫1 h，迅速冷卻至室溫，按上述方法測殘余酶活力，以未保溫的酶液的酶活力為100

17、11。酶的最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性：將酶液分別加在不同pH(pH 3.011.0) 的緩沖液中，按標(biāo)準(zhǔn)方法測酶活力，以酶活力最高者為100。將酶液用不同pH(pH 3.011.0) 的緩沖液稀釋，37保溫1 h后，測殘余酶活力，以未保溫的酶液的酶活力為10012。金屬離子對純化酶活力的影響：在酶反應(yīng)體系內(nèi)加入不同的金屬離子，各種金屬離子的終濃度分別為2 mmol/L，在37下保溫30 min，測剩余酶活，以不含金屬離子的反應(yīng)液為對照13。抑制劑對純酶活性的影響：采用2 mmol/L和5 mmol/L的不同抑制劑(EDTA、EGTA、PMSF、Leupeptin、N-ethylmaleimide

18、) 的緩沖液，以未加的酶活力為100，測定相對酶活的變化。酶的底物特異性：分別以骨明膠、可溶性型膠原蛋白、型膠原蛋白、型膠原蛋白、牛血清白蛋白 (BSA) 為作用底物，以骨明膠測定的酶活為100計，測定相對酶活。 1.2.5 BCC酶解骨膠原蛋白的產(chǎn)物的SDS-PAGE分入20 mmol/ L Tris-HCl (pH 7.5) 緩沖液溶液溶解的1 mg/mL可溶性I型膠原0.3 mL，37反應(yīng)30 min，然后加入0.6 mL 10三氯乙酸 (TCA) 終止反應(yīng)，以先加終止液的相同反應(yīng)物為對照，反應(yīng)物10 000 ×g離心10 min，取上清液0.2 mL加入0.5 mL，茚三酮顯

19、色溶液，充分混合后，蓋住試管口，在100水浴中加熱15 min，冰水冷卻5 min后，加入2.5 mL 60丙醇稀釋。充分混勻后，570 nm處比色。酶活力單位定義為：在37、pH 7.5條件下，每分鐘水解膠原產(chǎn)生相當(dāng)于1 µmol亮氨酸的酶量為1個酶活力單位(U)。1.3.2 蛋白質(zhì)含量的測定方法以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。 采用Bradford法17測定，1.3.3 分子量的測定方法按Laemmli等18的SDS-PAGE方法進(jìn)行。分離膠濃度為15，濃縮膠濃度為5。2 結(jié)果與分析2.1 產(chǎn)BCC菌株的篩選結(jié)果從湖南和河南骨骼加工廠堆積骨骼處采集到50份土樣先經(jīng)液體富集培養(yǎng)48 h，稀釋

20、涂布于LB培養(yǎng)基上形成單菌落。再點(diǎn)接于初篩培養(yǎng)基中進(jìn)行初篩，選擇細(xì)菌水解透明圈直徑與菌徑之比較大的進(jìn)行搖床發(fā)酵復(fù)篩，發(fā)酵液測定膠原蛋白酶活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明骨膠原蛋白水解所形成的透明圈的大小與細(xì)菌產(chǎn)膠原蛋白酶的能力具有相關(guān)性。經(jīng)富集培養(yǎng)通過初篩、復(fù)篩，分離出的60株細(xì)菌能分泌膠原蛋白酶。其中有3株產(chǎn)酶能力均在30 U/mL以上。有一株編號為MBL13的細(xì)菌每毫升發(fā)酵液含膠原蛋白酶的活力達(dá)36.80 U/mL，經(jīng)單株分離且連續(xù)傳代產(chǎn)酶能力無明顯下降。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性、16S rDNA 序列分析和傅里葉紅外測定細(xì)胞結(jié)構(gòu)，鑒定該菌株為蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus (另文發(fā)表)。

21、析及其對比實(shí)驗(yàn)自制骨膠原蛋白14-155 g，加入100 mL 蒸餾水中，90熱處理20 min。冷卻后加入純化BCC酶液和膠原酶型標(biāo)準(zhǔn)品酶液，37下酶解反應(yīng)，于不同酶解時間取樣，酶解液在SDS-PAGE上電泳分析，分離膠濃度為15，濃縮膠濃度為5。2.2 BCC酶的分離純化通過硫酸銨沉淀、DEAE-Cellulose-52離子交換層析及Sephadex G-100凝膠過濾對MBL13 發(fā)酵液中的酶進(jìn)行分離純化，結(jié)果見表1。1.3 測定指標(biāo)與方法 1.3.1 BCC酶活性的測定方法采用茚三酮顯色法16。取0.01 mL酶液，加劉麗莉等: 膠原蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選及酶的分離純化197表1 MBL1

22、3菌產(chǎn)BCC酶的純化Table 1 Purification of the BCC collagenase from MBL13Purification step Crude enzyme Ammonium sulphate Sephadex G100Total activity (U)77570 51563 19542Total protein (mg) Specific activity (U/mg)643 11721 8120 4411439 2443Purification (fold)1.0 3.7 20.4Yield (%) 100 66.5 25.2DEAE-Cellulose-

23、52 30210 12.0 38.9經(jīng)過純化后的BCC酶活達(dá)到2443 U/mg，提純倍數(shù)為20.4，得率為25.2。各步提取的酶樣品用SDS-PAGE檢測 (圖1)，結(jié)果表明硫酸銨沉淀樣品A中雜帶較多，樣品B中蛋白酶已占主要部分，樣品C中已是單一條帶，表明蛋白酶已達(dá)到電泳純。最終純化的膠原蛋白的分子量約為38 kDa。接近于一般細(xì)菌所產(chǎn)蛋白酶1835 kDa的分子量19。2.3 BCC酶反應(yīng)最適溫度和熱穩(wěn)定性純酶液與可溶性型膠原蛋白溶液等體積混和，在1070的溫度下反應(yīng)30 min，測得酶的最適作用溫度為40。將酶液在不同的溫度下分別保溫1 h后立即在0冰浴中冷卻，然后在37下測酶活，以剩余

24、的酶活性作為評價酶的熱穩(wěn)定性的指標(biāo)。結(jié)果顯示，純化酶在1040保溫1 h保留75以上的酶活力；50保溫1 h 后，剩余的酶活為60左右，在60保溫1 h僅剩10酶活，表明純化酶不能耐受高溫，熱穩(wěn)定性一般 (圖2)。圖2 溫度對BCC酶活的影響Fig. 2 Effect of temperature on the enzyme activity of BCCcollagenase. The optimal temperature for the enzyme activity () was determined at different temperatures (10°C70

25、6;C). The enzyme was preincubated at 10°C70°C for 1 h to determine the stability () of the enzyme activity.2.4 BCC酶最適反應(yīng)pH和pH 穩(wěn)定性取純酶液0.5 mL，加入9.5 mL不同pH的緩沖液 (pH 3.011.0)，與可溶性型膠原蛋白等體積混合，在37保溫30 min測定酶活的變化。如圖3所示，在 pH 7.08.0之間酶活力都較高，酶的最適pH為8.0。將適量酶液與不同pH 緩沖液在37預(yù)處理1 h 后，測定剩余酶活力。pH 7.08.5之間剩余酶活仍

26、能保持在 80以上。在 pH 3.07.0之間，隨著pH的降低，剩余酶活力顯著下降；pH 8.510.0之間，隨著pH的增大，酶活從80急劇下降為2。2.5 不同金屬離子對BCC酶活的影響在酶與底物的反應(yīng)體系中，加入不同的金屬離子，使其終濃度為2 mmol/L，以不加金屬離子的酶圖1 各步分離純化蛋白的SDS-PAGE電泳圖Fig. 1 SDS-PAGE analysis of the protein bands from the variouspurification steps. 1: protein marker; 2: DEAE-Cellulose-52 column chromato

27、graphy; 3: ammounium sulfate precipitation; 4: purified collagenase. Protein was stained with Commassie Brilliant Blue R 250 staining.活為100，測定其酶活 (圖4)。多種金屬陽離子對Zn2+、Mg2+該酶的活性都有較大的影響，其中Ca2+、對酶有激活作用，Ca2+能提高純化酶的活性；金屬離子Cu2+對酶有顯著的抑制作用；其他金屬離子也對酶活有一定的影響作用，但作用不明顯。198 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech

28、February 25, 2010 Vol.26 No.2原蛋白型膠原蛋白型膠原蛋白，對BSA沒有作用。經(jīng)方差分析，不同底物對相對酶活的影響存在極顯著 (P0.01)。即底物為型膠原蛋白時，相對酶活顯著高于型膠原蛋白和型膠原蛋白。由于骨骼中型膠原蛋白占總蛋白的8590。，因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該菌所產(chǎn)酶對型骨膠原蛋白圖3 pH值對BCC酶活的影響Fig. 3 Effect of pH on the enzyme activity of BCC collagenase. The optimal pH for the activity () and pH stability () of the enz

29、yme were determined at various pHs (pH 3.011.0), with the reactions preincubated at the given pHs for 1 h. The buffers used were 50 mmol/L sodium citrate (pH 3.06.6), 50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.09.0), and 50 mmol/L Na2CO3-NaHCO3 (pH 9.1610.83). To determine the stability, the enzyme was preincubated a

30、t 37°C for 1 h in each of the specified buffer.具有特異性，純化BCC酶屬于骨膠原蛋白酶。2.8 膠原蛋白酶的酶解產(chǎn)物分析及其對比實(shí)驗(yàn)為了進(jìn)一步了解純化的BCC酶的酶解能力，將其應(yīng)用于骨膠原蛋白的水解，并針對相同酶活的純化BCC酶和膠原酶型標(biāo)準(zhǔn)品 (美國) 進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)。酶解產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析結(jié)果見圖6、7。表2 抑制劑對BCC酶活的影響Table 2 Effect of inhibitors on the enzyme activity of BCC collagenaseInhibitorsRelative activity

31、 (%) 2 mmol/L5 mmol/LNone 100 100EDTA 7 3EGTA 10 6圖4 金屬離子對BCC酶活的影響Fig. 4 Effect of metal ions on the enzyme activity of BCCcollagenase.PMSF 98 93 Leupeptin 93 87 N-ethylmaleimide 89 812.6 抑制劑對BCC酶活的影響以未加抑制劑的樣品為對照，測定含有抑制劑的樣品的膠原蛋白酶活性，從而計算出抑制劑的作用效率，以膠原蛋白酶的相對剩余酶活來表示，結(jié)EDTA和EGTA可以強(qiáng)烈抑制純化的膠原果見表2。蛋白酶活性，N-eth

32、ylmaleimide、PMSF和Leupeptin對純化酶的活性影響較小，可以保留近80的相對酶活；由于金屬蛋白酶在反應(yīng)中心需要二價金屬離子，而且通常能抑制二價金屬離子作用的EDTA和EGTA被稱為金屬蛋白酶的抑制劑20。因此，該純化酶表明是一種金屬蛋白酶。圖5 純化酶對底物的特異性Fig. 5 Substrate specificity of BCC collagenase.將純化的BCC酶應(yīng)用于骨膠原蛋白的水解，該酶水解骨膠原蛋白得到的最終產(chǎn)物為低分子量的多肽，隨著酶解時間的增加，肽的分子量隨之變小。而且水解后產(chǎn)生的多肽并不是連續(xù)的，說明該酶對骨膠原蛋白的水解是特異的，具有特定的酶切位點(diǎn)

33、。這也進(jìn)一步說明該酶為膠原蛋白酶，通過控制酶解時間，可以得到不同鏈長的多肽。即該酶可以用于骨膠原蛋白的水解生產(chǎn)骨多肽，可有望用于骨骼的深加工生產(chǎn) (圖6)。2.7 BCC酶的底物特異性分別以骨明膠、可溶性型膠原蛋白、型膠原蛋白、型膠原蛋白、牛血清白蛋白 (BSA) 為底物，測定適當(dāng)稀釋后純化酶液的酶活性高低，以明膠為底物作為對照，測定相對酶活的變化，結(jié)果見圖5。純化酶對底物的作用順序?yàn)椋汗敲髂z型膠劉麗莉等: 膠原蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選及酶的分離純化199變性，成本較高。本研究利用骨明膠為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，從堆積骨骼處分離得到一批產(chǎn)膠原蛋白酶活性的菌株，篩選出一株MBL13，經(jīng)鑒定為蠟樣芽孢桿菌

34、Bacillus cereus，其不但產(chǎn)酶量高，而且酶的活性強(qiáng)，具有重要的研究開發(fā)價值。在膠原蛋白酶的純化過程中，經(jīng)硫酸銨沉淀、DEAE- Cellulose-52離子交換層析及Sephadex G-100凝膠過圖6 純化酶酶解骨膠原蛋白的SDS-PAGE電泳圖Fig. 6 SDS-PAGE analysis of bone collagen digested with the purified enzyme. 1: enzymolysis time 60 min; 2: enzymolysis time 120 min.濾純化后，得到分子量為38 kDa的BCC酶，該酶的比活力達(dá)到2443

35、U/mg，提純倍數(shù)為20.4，得率為25.2。酶學(xué)性質(zhì)研究表明，BCC酶最適作用溫度為40，最適作用pH為8.0。pH穩(wěn)定范圍為7.08.5，其熱穩(wěn)定性一般，酶活最佳保持在60以下。因此，有待進(jìn)一步提高酶活熱穩(wěn)定性的研究，使之更廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。除了金屬離子Cu2+明顯抑制酶的活性外，其他離子對酶活性的影響不大，這些生理特性賦予了BCC酶在工業(yè)中有極大的應(yīng)用優(yōu)勢。抑制劑實(shí)驗(yàn)表明該純化酶是一種金屬蛋白酶，該酶的底物特異性表明酶對型膠原蛋白有極顯著的特異性，為一種骨膠原蛋白酶。對比實(shí)驗(yàn)表明純化的BCC酶水解能力強(qiáng)于標(biāo)準(zhǔn)品膠原酶型，因此具有極大的開發(fā)潛力。針對骨骼的酶解研究，相關(guān)報道很多，但我國

36、卻沒有骨專用的膠原蛋白產(chǎn)品，而且目前我國有關(guān)膠原蛋白酶的生產(chǎn)成本高，產(chǎn)量有限，限制了該酶的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)從骨骼堆積處的土樣中篩選到的降解骨膠原蛋白的菌株MBL13，為開發(fā)骨骼深加工提供了新的思路，為解決工業(yè)化生產(chǎn)膠原蛋白酶提供了新型的專用生產(chǎn)出發(fā)菌。圖7 酶解骨膠原蛋白的SDS-PAGE對比分析Fig. 7 SDS-PAGE analysis of bone collagen digested withBCC collagenase and collagenase I. 1: the collagen polypeptides by BCC collagenase hydrolyzing bon

37、e collagen at 90 min; 2: the collagen polypeptides by collagenase I (standard sample, USA, Sigma) hydrolyzing bone collagen at 90 min; 3: protein marker.由圖7可知，在相同的酶解條件下，純化的BCC酶的酶解液中大部分多肽條帶的分子量低于膠原酶型標(biāo)準(zhǔn)品。即表明在統(tǒng)一的酶解條件下，BCC酶能產(chǎn)生更多低分子量的骨膠原多肽。因此，結(jié)果表明MBL13所產(chǎn)的BCC酶酶解骨膠原蛋白的能力強(qiáng)于標(biāo)準(zhǔn)品膠原酶型。REFERENCES1 Olsen D, Yang

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