固定化微生物技術(shù)及其在污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用_司友斌

1、土 壤(Soils, 2007, 39 (5: 673676固定化微生物技術(shù)及其在污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用司友斌, 彭 軍(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,合肥 230036摘要:固定化微生物技術(shù)是一種新的生物處理技術(shù),與普通生物處理法相比有許多優(yōu)點(diǎn)。本文對(duì)固定化微生物的制備方法、固定化微生物的載體、固定化微生物的反應(yīng)特性以及固定化微生物技術(shù)在污染土壤治理中的應(yīng)用和研究進(jìn)展?fàn)顩r進(jìn)行了綜述,并對(duì)其今后的發(fā)展方向作了探討。關(guān)鍵詞:固定化微生物;載體;土壤修復(fù)中圖分類號(hào): S154.3固定化微生物技術(shù)是20世紀(jì)60年代由生物化工中的固定化酶技術(shù)發(fā)展起來(lái)的生物處理技術(shù)1, 2。所謂固定化技術(shù),是指利用物理或化

2、學(xué)手段將游離的微生物或酶,定位于限定的空間區(qū)域并使其保持活性和可反復(fù)使用的一種基本技術(shù)3。與其他應(yīng)用游離微生物的過(guò)程相比,固定化微生物技術(shù)可以使微生物在某一固定區(qū)域具有較高的密度,減輕或消除微生物的流失,提高反應(yīng)速度,同時(shí)便于培養(yǎng)優(yōu)勢(shì)微生物種群,提高處理過(guò)程的穩(wěn)定性,減少或消除副反應(yīng)的發(fā)生,便于控制處理過(guò)程4-6。目前,固定化微生物技術(shù)已成為國(guó)內(nèi)外生物科學(xué)、環(huán)境科學(xué)及其相關(guān)學(xué)科的研究重點(diǎn)。1 固定化微生物的制備方法固定化微生物的制備方法多種多樣,任何一種限制細(xì)胞自由流動(dòng)的技術(shù),都可以用于制備固定化細(xì)胞。一般來(lái)說(shuō),大致可以分成吸附法、包埋法、共價(jià)結(jié)合法和交聯(lián)法等4大類7-10,其中吸附法與包埋法

3、最為常用。1.1 吸附法吸附法是利用微生物所具有的可吸附到固體物質(zhì)表面或其他細(xì)胞表面的能力,將微生物吸附在附加劑表面的方法,這是一種非常廉價(jià)和有效的微生物固定化方法。吸附法可分為物理吸附和離子吸附。物理吸附是使用具有高吸附能力的物質(zhì),如硅膠、活性炭、多孔玻璃、石英砂、纖維素、硅藻土、多孔磚等吸附劑,將微生物吸附在表面使其固定化。離子吸附是利用微生物在解離狀態(tài)下離子健合作用而固定于帶有相反電荷的離子交換劑上,常見(jiàn)的離子交換劑有DEAE-纖維素、CM-纖維素等。吸附法實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單,操作容易,反應(yīng)條件溫和,對(duì)微生物活性影響小,載體可重復(fù)使用,但微生物與載體的結(jié)合力較弱,穩(wěn)定性差,微生物菌體易脫落。1.2

4、 包埋法包埋法是使微生物細(xì)胞擴(kuò)散進(jìn)入多孔性載體內(nèi)部,或利用高聚物在形成凝膠時(shí)將細(xì)胞包裹在網(wǎng)格結(jié)構(gòu)中或半透性聚合薄膜內(nèi),小分子的底物和產(chǎn)物可以自由擴(kuò)散,而細(xì)胞卻不會(huì)擴(kuò)散到周?chē)橘|(zhì)中去。包埋法又可分為高分子合成包埋、離子網(wǎng)絡(luò)包埋及沉淀包埋,是目前研究最廣泛的固定化方法。包埋法操作簡(jiǎn)單,對(duì)微生物活性影響小,制作的固定化微生物小球的強(qiáng)度高,但包埋材料會(huì)一定程度阻礙底物和氧擴(kuò)散,并對(duì)大分子底物不適用。1.3 共價(jià)結(jié)合法共價(jià)結(jié)合法是微生物細(xì)胞表面上的功能團(tuán)和固相支持物表面的反應(yīng)基團(tuán)之間形成化學(xué)共價(jià)鍵連接,從而形成固定化微生物。該法細(xì)胞與載體之間的連接鍵很牢固,使用過(guò)程中不會(huì)發(fā)生脫落,穩(wěn)定性好,但反應(yīng)條件激

5、烈,操作復(fù)雜,控制條件苛刻。利用此法制備的固定化微生物,細(xì)胞大多死亡。1.4 交聯(lián)法交聯(lián)法是利用兩個(gè)功能團(tuán)以上的試劑直接與微生物細(xì)胞表面的反應(yīng)基團(tuán)如氨基、羥基等進(jìn)行交聯(lián),形成共價(jià)鍵來(lái)固定微生物。常用的交聯(lián)劑有戌二醛、甲苯二異氰酸酯等。此法化學(xué)反應(yīng)條件劇烈,對(duì)細(xì)胞活性影響大,實(shí)際常與其他方法結(jié)合。聚集-交聯(lián)固定法是使用凝聚劑基金項(xiàng)目:國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA06Z356、安徽省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(0701*和安徽省優(yōu)秀青年科技基金項(xiàng)目(06041082資助。作者簡(jiǎn)介:司友斌(1968,男,安徽巢湖人,博士,教授,主要從事環(huán)境污染物生物修復(fù)方面的研究。E-mail: yb

6、si2002674 土壤第39卷將菌體細(xì)胞形成細(xì)胞聚集體,再利用雙功能或多功能交聯(lián)劑與細(xì)胞表面的活性基團(tuán)發(fā)生反應(yīng),使細(xì)胞彼此交聯(lián)形成穩(wěn)定的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這樣,高效菌體不易流失,生物濃度高,從而提高了處理效果。2 固定化微生物的載體理想的固定化微生物細(xì)胞載體應(yīng)該具有以下特征:對(duì)微生物細(xì)胞無(wú)毒性,傳質(zhì)性能好,透氣性和透光性良好,性質(zhì)穩(wěn)定,不易被微生物分解,機(jī)械強(qiáng)度高,使用壽命長(zhǎng),價(jià)格低廉等。目前常用的微生物固定化載體材料大致可分為有機(jī)載體、無(wú)機(jī)載體和復(fù)合載體3大類11-13。2.1 有機(jī)高分子載體材料有機(jī)高分子載體材料又分為天然高分子凝膠載體和合成有機(jī)高分子凝膠載體。天然高分子凝膠載體一般對(duì)生物無(wú)

7、毒性,傳質(zhì)性能好,但強(qiáng)度較低,在厭氧條件下易被微生物分解,壽命短。常見(jiàn)的此類載體有瓊脂、角叉萊膠、海藻酸鈉等。在這幾種天然載體中,瓊脂強(qiáng)度最差。天然的角叉萊膠在分離出影響其強(qiáng)度的-角叉萊膠成分后,強(qiáng)度和穩(wěn)定性有所提高,但價(jià)格較貴。相比之下,海藻酸鈉具有價(jià)格低廉、制備容易、傳質(zhì)性能好等優(yōu)點(diǎn),應(yīng)用最為廣泛。合成有機(jī)高分子凝膠載體一般強(qiáng)度較大,但傳質(zhì)性能較差,在進(jìn)行細(xì)胞固定時(shí)對(duì)細(xì)胞活性有影響。常見(jiàn)的此類載體有聚丙烯酰銨(簡(jiǎn)稱ACAM、聚乙烯醇(簡(jiǎn)稱PV A、光硬化樹(shù)脂、聚丙烯酸凝膠等。聚丙烯酰銨(ACAM凝膠在包埋細(xì)胞時(shí),由于交聯(lián)過(guò)程中的放熱以及交聯(lián)試劑本身的毒性,細(xì)胞在固定化過(guò)程中往往失活。對(duì)此,

8、可采取先用天然高分子凝膠瓊脂包埋細(xì)胞后,再用ACAM進(jìn)行包埋的二次包埋固定化方法,以克服此弱點(diǎn)。固定化有機(jī)載體的制備方法主要采用包埋法。此法是利用高聚物在形成凝膠時(shí)將細(xì)胞包埋在其內(nèi)部,從而達(dá)到固定細(xì)胞的目的14。2.2 無(wú)機(jī)載體材料無(wú)機(jī)載體如多孔陶珠、活性炭、硅藻土、紅磚碎粒、砂粒等,具有機(jī)械強(qiáng)度大、對(duì)微生物無(wú)毒性、不易被微生物分解、耐酸堿、成本低、壽命長(zhǎng)等特性,因而是一類重要的載體材料15-16。無(wú)機(jī)載體大多具有多孔結(jié)構(gòu),在與微生物接觸時(shí),利用吸附作用和電荷效應(yīng),從而把微生物固定。無(wú)機(jī)載體內(nèi)部有較大的孔隙度,可以容納不斷增殖的微生物,使得載體內(nèi)細(xì)胞濃度增大,提高了處理效率。無(wú)機(jī)載體的固定化方

9、法簡(jiǎn)單易行,只需把載體放入含有微生物一定濃度的溶液中,固定一段時(shí)間(一般為24 h左右即可。常見(jiàn)的幾種無(wú)機(jī)載體中,多孔陶珠的吸附能力強(qiáng),孔徑可調(diào)控。針對(duì)不同大小的微生物,可選用相應(yīng)規(guī)格的陶珠作載體,靈活度大。但在現(xiàn)有條件下,大規(guī)模制造陶珠仍有一定困難,成本較高?；钚蕴渴且环N來(lái)源廣、成本低、易制造的細(xì)胞固定化載體材料,在吸附性能、酸堿耐受性、細(xì)胞的增殖速度及處理效果方面,具有實(shí)用性,具備了載體材料的基本條件,有較大的應(yīng)用前景。2.3 復(fù)合載體材料由于有機(jī)載體材料和無(wú)機(jī)載體材料各有優(yōu)缺點(diǎn),而兩類材料在許多性能方面互補(bǔ),因此,可將這兩類載體材料結(jié)合,組成復(fù)合載體材料,以改進(jìn)材料的性能17。Lin等人

10、18在這方面進(jìn)行了嘗試,他們利用海藻酸鈣凝膠聯(lián)合包埋固定Phanerochaete chrysosporium和粉末活性炭,用于降解五氯酚 (PCP。他們所用復(fù)合固定化體系包括3個(gè)組分:生物催化劑、吸附劑和固態(tài)底物;其中,吸附劑主要用于富集有毒污染物,提供給微生物進(jìn)一步生物降解,并能減輕其對(duì)生物催化劑的抑制作用;固態(tài)底物用于支持降解并減少其他生物的干擾。結(jié)果表明:復(fù)合固定化體系能更加有效地降解PCP,顯示出復(fù)合載體材料的優(yōu)越性。3 固定化微生物的反應(yīng)特性微生物經(jīng)過(guò)固定化后,其中主要包括微生物穩(wěn)定性、微生物活性、氧和底物傳質(zhì)速率等反應(yīng)特性都發(fā)生了變化,這些變化決定了固定化微生物與游離微生物在處理

11、過(guò)程以及工藝上的差異19-20。3.1 微生物穩(wěn)定性的變化微生物從本質(zhì)上講也是一種含有多種官能團(tuán)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),因此,經(jīng)固定化后的微生物其官能團(tuán)與載體之間發(fā)生了共價(jià)鍵或范德華力等形式的作用,主鏈結(jié)構(gòu)得到加固,不易流失,不易被破壞,能耐pH變化、有機(jī)物濃度的變化、生物毒性物質(zhì)等的沖擊,不易失活。3.2 微生物活性的變化微生物固定化后,由于官能團(tuán)穩(wěn)定性的增加,其生物活性有所減弱,但由于微生物在一定區(qū)域空間內(nèi)具有高密度,因此單個(gè)微生物活性降低的缺陷可以得到彌補(bǔ)。3.3 氧和底物傳質(zhì)速率的變化第5期司友斌等:固定化微生物技術(shù)及其在污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用675由于載體的作用,使得反應(yīng)系統(tǒng)中主體與微生物所處區(qū)

12、域的底物及氧濃度有差異,固定化后氧傳質(zhì)受到的阻礙更為明顯,所以好氧條件下,受氧傳質(zhì)的限制,固定化微生物處理的污染物濃度不宜過(guò)高,以免限制了高密度微生物活性的發(fā)揮;厭氧下由于不受氧傳質(zhì)的影響,污染物濃度可大大高于好氧條件,固定化微生物的處理能力可以得到充分體現(xiàn),并且可長(zhǎng)時(shí)間保持較高的生物量和活性,充分顯示出固定化微生物的優(yōu)越性。4 固定化微生物技術(shù)在污染土壤治理中的應(yīng)用固定化微生物技術(shù)已在某些水相污染物處理中顯示了一定的技術(shù)優(yōu)勢(shì),如難降解的有機(jī)廢水、含高濃度重金屬離子的廢水、生活污水和高濃度有機(jī)廢水以及毒性檢驗(yàn)和生物檢測(cè)等21-24,但在污染土壤治理中的應(yīng)用則剛剛起步。王新等25-27采用蓮藕狀

13、聚乙烯醇復(fù)合載體對(duì)鐮刀菌固定化包埋,分別進(jìn)行了不同接種量的固定化真菌對(duì)菲、芘的降解;固定化真菌對(duì)不同系列濃度菲、芘的降解試驗(yàn);以及對(duì)固定化真菌在自然土壤中對(duì)菲、芘降解的各項(xiàng)參數(shù)作了測(cè)定,同時(shí)用電鏡觀察研究了鐮刀菌在固定化載體中的分布形態(tài)。結(jié)果表明:固定化真菌具有較好的降解效果,固定化真菌在360 h時(shí),對(duì)菲、芘的降解效率分別為76.96%和20.69%,而自然土壤中土著菌僅達(dá)到33.37%和15.28%。徐容等28研究了固定化產(chǎn)黃青霉廢菌體對(duì)Pb2+ 的吸附與脫附平衡,結(jié)果表明:固定化產(chǎn)黃青霉廢菌顆粒對(duì)Pb2+的吸附受pH的影響較大,在pH值為2 5時(shí),吸附量隨pH值的增大而呈線性增加;在pH

14、值>5以后,逐漸趨于最大值,固定化產(chǎn)黃青霉廢菌顆粒吸附Pb2+ 的最佳pH值為5.0 5.5;溫度對(duì)其吸附的影響不大,表明固定化廢菌顆粒對(duì)Pb2+ 的吸附可能與離子交換有關(guān); Pb2+ 初始濃度與吸附劑量之比對(duì)吸附的影響很大,隨比值的增加,吸附量增大,所以吸附液的最初濃度不宜太大。徐容等28還選擇了硝酸、硝酸銨、硝酸鈉、氯化鈣、醋酸鉀和乙二胺四乙酸 (EDTA 對(duì)洗脫劑進(jìn)行比較,結(jié)果表明:EDTA是脫附固定化產(chǎn)黃青霉廢菌顆粒上所吸附Pb2+ 的較為理想的脫附劑。在保持其脫附率為100%的條件下,用0.1 mol/L的EDTA做脫附液時(shí),Pb2+ 終濃度最高可達(dá)20700 mg/L,最大固

15、液比可達(dá)到295,濃縮因子可達(dá)113,對(duì)廢水中的Pb2+ 有很好的回收作用。5 結(jié)語(yǔ)固定化微生物技術(shù)在環(huán)境工程中的應(yīng)用前景是不可估量的,但目前此類技術(shù)還存在許多問(wèn)題有待于研究,相應(yīng)地就形成了今后一段時(shí)間里固定化技術(shù)的研究方向:(1 載體是固定化技術(shù)重要的組成部分,進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新型性能優(yōu)良的固定化載體、提高固定化微生物的活性及濃度、改善固定化技術(shù)的處理效果及使用性能,對(duì)固定化技術(shù)的發(fā)展至關(guān)重要。(2 實(shí)際污染物是一個(gè)十分復(fù)雜的混合體系,用單一菌種處理一般很難達(dá)到要求,因此對(duì)于復(fù)雜的污染物體系,是采用混合菌還是單一高效菌分級(jí)處理,有待于進(jìn)一步研究。(3 固定化技術(shù)目前應(yīng)用的范圍還比較小,如何把基因工

16、程菌和固定化技術(shù)結(jié)合起來(lái),拓寬可處理污染物的種類,從而使固定化技術(shù)可以更加廣泛地運(yùn)用,應(yīng)是今后研究的重點(diǎn)。總之,固定化技術(shù)為充分發(fā)揮高效菌種或遺傳工程菌在污染物治理中的降解潛力,防止其泄露而引起生態(tài)問(wèn)題提供了一個(gè)十分重要的手段。可以預(yù)見(jiàn),隨著固定化技術(shù)的不斷研究和發(fā)展,該技術(shù)在土壤污染控制中的應(yīng)用將首先在有機(jī)污染物的治理方面邁出實(shí)用化步伐。參考文獻(xiàn):1 王建龍. 生物固定化技術(shù)與水污染控制. 北京: 科學(xué)出版社,2002: 294-2952 沈耀良, 黃勇, 趙丹, 宋吟玲, 李勇.固定化微生物污水處理技術(shù). 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 20023 王洪祚, 劉世勇.酶和細(xì)胞的固定化. 化學(xué)通報(bào)

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