豆制品火鍋麻辣燙等食品中喹諾酮類化合物的測(cè)定

1、豆制品、火鍋、麻辣燙等食品中喹諾酮類化合物的測(cè)定BJS 2019091范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豆腐、豆干、火鍋底料、麻辣燙底料及火鍋和麻辣燙的食材中諾氟沙星、 氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氟羅沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、司帕沙星、環(huán)丙沙星、 達(dá)氟沙星、恩諾沙星的高效液相色譜 -串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于豆腐、豆干、火鍋底料、麻辣燙底料及火鍋和麻辣燙的食材中諾氟沙星、 氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氟羅沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、司帕沙星、環(huán)丙沙星、 達(dá)氟沙星、恩諾沙星的測(cè)定和確證。2原理采用0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液提取樣品中的喹諾酮類化合物，經(jīng)離心和過濾后，上清液經(jīng)H

2、LB固相萃取柱凈化后，用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)和確證，內(nèi)標(biāo)法定量。3試劑和材料以下所用的試劑，除特別注明外均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。3.1 乙腈（CH3CN）:色譜純。3.2 甲醇（CH3OH ）:色譜純。3.3 甲酸（CHOOH ）:色譜純。3.4 甲醇（CH3OH ）。3.5 氨水（NHQH ）:濃度 25% 28%。3.6 乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2Na2O8 2出0）。3.7 檸檬酸（C6H8O7H2O）。3.8 磷酸氫二鈉（Na2HPO4 12H2O）。3.9 氫氧化鈉（NaOH ）。3.10 鹽酸（HCI ）:含 HCI 38%。3.11乙酸銨（

3、CH3COONH4）:色譜純。3.12 磷酸氫二鈉溶液 （0.2 mol/L ）：稱取 71.63 g 磷酸氫二鈉 （3.8），用水溶解并定容至 1000 mL。3.13檸檬酸溶液（0.1 mol/L）:稱取21.01 g檸檬酸（3.7）,用水溶解并定容至 1000 mL。3.14 Mcllvaine 緩沖溶液：將 1000 mL 0.1 mol/L 檸檬酸溶液（ 3.13）與 625 mL 0.2 mol/L 磷酸氫二鈉溶液（ 3.12）混合，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 至 4.00.1。3.15 EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液（0.1 mol/L ）：稱取 60.5g 乙二胺四乙酸二

4、鈉 （3.6）至 1625mL Mcllvaine 緩沖溶液（ 3.14）中，超聲使其溶解。3.16 5%甲醇水溶液：取 5 mL 甲醇（ 3.4），用水稀釋至 100 mL。3.17 25%氨水甲醇溶液：取 25 mL 氨水（ 3.5），用甲醇（ 3.4）稀釋至 100 mL。3.18 標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品中文名稱、英文名稱、 CAS 登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量見附錄 A 表A.1，純度99%。3.19標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制：分別精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品（3.18）約10 mg,置10 mL容量瓶中，加入0.2 mL 甲酸（ 3.3），超聲使溶解，用乙腈（ 3.1）定容至刻度，搖勻，配制成濃度為 1.0 mg/m

5、L 的標(biāo) 準(zhǔn)儲(chǔ)備液，轉(zhuǎn)移至溶劑瓶中于 -18 C以下避光保存，有效期 6個(gè)月。3.20混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（3.19） 1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇（3.2）定容至刻度,配制成濃度為 0.01 mg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（環(huán)丙沙星、沙拉沙星濃度約0.015mg/mL ）,于4C以下避光保存，有效期 3個(gè)月。3.21混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液的配制：準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（3.20） 1 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇（3.2）定容至刻度，配制成濃度為1.0卩g/m的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（環(huán)丙沙星、沙拉沙星濃度約1.5卩g/m）,于4C以下避光保存，臨用新配。3.22內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

6、配制：分別稱取氘代同位素標(biāo)準(zhǔn)品（3.18）約10 mg,至10 mL容量瓶中，加入0.2 mL甲酸（3.3）,超聲溶解，用乙腈（3.1）稀釋至刻度，配制成濃度為 1.0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 C以下避光保存，有效期 6個(gè)月。3.23混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間溶液的配制：準(zhǔn)確吸取內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（3.22） 0.01mL于10 mL容量瓶中，用甲醇（3.2）定容至刻度，配制成濃度為 1.0卩g/m的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，于 4C 以下避光保存,臨用新配。3.24固相萃取小柱（500 mg, 6 mL ）： HLB柱或相當(dāng)者。使用前依次以 6 mL甲醇、6mL水活 化,保持柱體濕潤(rùn)。4 儀器和設(shè)

7、備4.2 分析天平：感量 0.001g 和 0.00001 g。4.3 渦旋振蕩器4.4 超聲儀4.5離心機(jī)：轉(zhuǎn)速 8000 r/min4.6 均質(zhì)器4.7 氮?dú)鉂饪s儀5 測(cè)定步驟5.1 試樣制備與保存豆制品、火鍋和麻辣燙的食材從待檢樣品中取出樣品約500g ，用組織搗碎機(jī)充分搗碎混勻，裝入潔凈容器中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記，于-18 C冷凍存放?；疱伒琢?、麻辣燙底料固體狀：從待檢樣品中取出樣品約500g,用組織搗碎機(jī)充分搗碎混勻，裝入潔凈容器中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記，于4 C冷藏存放。半固體狀：從待檢樣品中取出樣品約500g，放入研缽中，迅速研磨均勻，裝入潔凈容器中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記于4C冷藏存放。液

8、體狀：從待檢樣品中取出樣品約500g，攪拌均勻后裝入潔凈容器中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記，于4 C冷藏存放。5.2 樣品溶液制備提取：稱取5.0 g均勻樣品（精確至 0.001g）,置50 mL離心管中，精密加入混合內(nèi)標(biāo) 標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（3.23） 0.1mL，加入 20 mL 0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine緩沖溶液（3.15）,渦旋混勻1min，超聲提取15 min , 8000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至 50 mL容量瓶中，殘 渣用EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液（3.15）同法重復(fù)提取兩次，每次10 mL,合并上清液至同一容量瓶中，用 EDTA-Mcllvai

9、ne 緩沖溶液（ 3.15）定容至刻度，混勻。用濾紙過濾（必要 時(shí) 10000 r/min 離心 5 min 后過濾），續(xù)濾液待凈化。凈化：精密吸取上述待凈化液 25.0 mL,以約1 mL/min的流速全部通過固相小柱 （3.24）, 用3 mL 5%甲醇水溶液（3.16）淋洗，抽干，先后以6 mL甲醇、3 mL氨水甲醇（3.17）洗脫，合并甲醇及氨水甲醇洗脫液，45 C氮吹至近干，準(zhǔn)確加入2.0mL流動(dòng)相初始比例復(fù)溶液溶解殘?jiān)^0.22 yn濾膜，續(xù)濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。5.3基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備稱取5.0 g空白試樣（精確至 0.001g ）,置50 mL離心管中，除不加入

10、混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中 間溶液外，其余同5.2操作處理后得到空白基質(zhì)，共制備 6份。分別精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（3.21） 0 mL、0.010 mL、0.020 mL、0.050 mL、0.100mL、0.200 mL及混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（3.23）0.025 mL于試管中，氮吹至近干，精密加入1.0 mL空白基質(zhì)復(fù)溶，過 0.22 濾膜，制成濃度為 0 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（環(huán)丙沙星、沙拉沙星濃度為0 ng/mL、15 ng/mL、30 ng/mL、75 ng/mL、150 ng/mL、300

11、 ng/mL，同位素內(nèi)標(biāo)濃度約 25ng/mL ）。5.4測(cè)定 5.4.1液相色譜參考條件1） 色譜柱：C18色譜柱，2.1 mmx 50 mnK 1.7 ，或性能相當(dāng)者。2）柱溫：40C。3）流速：0.25 mL/min。4）進(jìn)樣量：2譏5） 流動(dòng)相：A-5 mmol/L乙酸銨水溶液（含 0.1%甲酸），B-乙腈。梯度洗脫條件見表1。表1梯度洗脫條件時(shí)間（min）A(%)B(%)09010390108703010703010.55951359513.190101590105.4.2質(zhì)譜參考條件1）電離方式：電噴霧電離（ESI）;2）掃描方式：正離子掃描；3）檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè) MRM ;4

12、）離子源參數(shù)參考條件：離子源接口電壓，4000 V ;離子源接口溫度，350 C;脫溶劑溫度，250 C;離子源加熱溫度，400 C；霧化氣流速，2.9 L/min ;干燥氣流速，10.0 L/min ;加熱氣流速，10.0 L/min。5）定性離子對(duì)、定量離子對(duì)參見表2。表2喹諾酮類藥物主要質(zhì)譜參數(shù)序號(hào)組分母離子子離子Q1預(yù)四極桿電壓碰撞電壓Q3預(yù)四極桿電壓（m/z）（m/z）（V）(V)（eV）1諾氟沙星320.2*302.0-16-21-21231.1-15-39-252氧氟沙星362.2*318.2-30-18-24261.1-30-28-193洛美沙星352.0*265.0-25-2

13、3-29308.0-25-17-224培氟沙星334.0290.1-25-18-20*316.2-25-21-225氟羅沙星370.0*326.0-30-20-23269.0-29-28-26342.0-15-19-256沙拉沙星386.2299.1-29-30-20*368.1-14-22-267雙氟沙星400.0*356.0-17-20-25299.0-17-28-288司帕沙星393.0*349.0-30-21-28292.0-30-21-24*314.1-25-21-229環(huán)丙沙星332.1287.8-24-17-30231.0-25-40-40*340.1-26-23-2410達(dá)氟沙

14、星358.0283.2-14-24-3082.1-26-44-15*342.1-27-20-2511恩諾沙星360.0316.0-13-20-22245.2-28-27-1712D8-環(huán)丙沙星340.3322.1-10-21-2213D5-恩諾沙星365.1321.1-11-19-2214D5-諾氟沙星325.3307.2-10-20-21注：1“”表示定量離子；2.所列質(zhì)譜參考條件是在島津（LC/MS-8050 ）質(zhì)譜儀上完成的，此處所列試驗(yàn) 用儀器型號(hào)僅供參考，不涉及商業(yè)目的，鼓勵(lì)方法使用者嘗試不同廠家或型號(hào)的儀器；3.對(duì)不同質(zhì)譜儀,儀器參數(shù)可能存在差異，測(cè)定前應(yīng)將質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化到最佳；4.

15、由于喹諾酮類化合物離子化受基質(zhì)干擾較為顯著，方法使用者可根據(jù)實(shí)際情況選擇表中所列離子對(duì)進(jìn)行定性定量測(cè)定。5.4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制取基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（5.3）按濃度由低到高依次進(jìn)樣檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。5.5定性在相同實(shí)驗(yàn)條件下，試樣中待測(cè)物質(zhì)的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間偏差 應(yīng)在戈.5%之內(nèi)；且試樣譜圖中各組分定性離子的相對(duì)豐度與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液定性離子的相對(duì) 豐度，其允許偏差不超過表 3規(guī)定的范圍時(shí)，則可確定為樣品中存在此種待測(cè)物?；|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM ）典型圖譜見附錄 B。表3定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差相對(duì)離子豐度，% 50% 20% 50% 10% 20%3

16、02.00(+) ：1:320.20231.10(+)1.50，1.25:1.00 ，0.75 j0.500.2510.00 12：362.20318.20(丨)2362.20261.10(+)1.000.750.500.250.000009 %星沙氟氧4.254.505(x100.000)3:352.00265.00(+)-3:352.00308.00(+)4.57556.006.254.256.504.506.75 4.750075006.506.757.00(x100.000)6.0 5:370.00326.00(+)5i:370.00269.00(+)9.08.0(x1.000.000

17、)4.254.50星沙羅氟10:358.00340.10(+)10:358.00283.20(+)10:358.0082.10(+)(x1.000.000)鋼4：334.00316.20(+)8.0 :4:334.00290.10(+)6.0,5.0；4.0 :3.0：2.0.1.0:0.0.6.57.(4.57.5 5.05.56.06.57.0(x 1.000.000)4.755.005.255.505.753.0 9:332.2.5：9:332.10287.80(+)：9:332.10231.00(+)2.01.51.00.5 :0.06.00 6.254.5r6g7j0(x1.000.

18、000)5.56.06.57.0- - - -5 0 52 211:360.00342.10(+)11:360.00316.00(+)11:360.00245.20(+)彳P星沙諾恩代(X100000)14.325.30307.20(+)2.001.751.501.251.000.750.500 2500(X 1000100)5.00(x 100,000)8.07.05.00.502.01.00.07.504星 沙 氟 諾5.255.505.756.006.256.506.757.007.250.20.10.01.00.90.80.70.60.50.40.3(X 1,08,000)：6:386.20368.10(|)6:386.20299.10(+)：6:386.20342.00(+)(x 1,0000100)2 7：400.00356.00(+)1.1 7:400.00299.00(+)6.758.393.00349.00(+)8:393.00292.00(+)3.002.752.502.252.0