冰片作用下尼莫司汀(ACNU)透過血腦屏障的藥動學(xué)研究

1、冰片作用下尼莫司?。ˋCNU）透過血腦屏障的藥動學(xué)研究史衛(wèi)忠1，趙志剛2 （1. 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院臨床藥學(xué)系，北京市 100083； 2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院藥劑科，北京市 100050）摘要：目的：研究冰片作用下尼莫司?。ˋCNU）透過血腦屏障的藥動學(xué)改變。方法：，將日本大耳白兔隨機對照分為冰片組和對照組，采集不同時間點的血液和腦脊液，HPLC 法測定尼莫司汀的濃度，藥物濃度時間曲線經(jīng)3P97 程序擬合，比較主要藥動學(xué)參數(shù)。結(jié)果：合用冰片后腦脊液中尼莫司汀的 Tmax、Cmax 和 AUC 均增加，血腦屏障通透率提高18.66%。證明冰片可提高尼莫司汀的生物利用度，增加其在腦脊

2、液的分布,有效促進尼莫司汀通過血腦屏障。關(guān)鍵詞：尼莫司汀,冰片,血腦屏障,高效液相色譜法,藥代動力學(xué) Pharmacokinetical Study of Nimustine (ACNU) through Blood Brain Barrier after Intragastric Administration of Borneol Shi wei-zhong1,Zhao zhi-gang2(1. Clinical Pharmacy College,Peking University Health Science Center, Beijing 100083, China;2. Departm

3、ent of pharmacy, Beijing Tiantan Hospital Affiliated to Capital Medical University, Beijing 100050, China)ABSTRACT: Objective: To observe the effect of borneol on the pharmacokinetics of Nimustine through Blood Brain Barrier in rabbits.Method: Japanese White Rabbits were randomly divided into contro

4、l group and borneol group.Blood and CSF samples were obtained after intravenous injection of nimustine with/without Borneol in different times.The concentrations of TMZ in plasma and cerebrospinal fluid were determined by high performance liquid chromatography . The plasma/CSF concentration-time cur

5、ves were fitted and the pharmacokinetic parameters were calculated with 3P97 practical pharmacokinetic program and compare the change of pharmacokinetics of nimustine after intragastric administration of borneol. Result: Tmax、Cmax and AUC were increased in borneol group and the permeability of Blood

6、 Brain Barrier(BBB) was increased by 18.66%. Borneol can increase the bioavailability of ACNU in CSF.The increase of concentration of nimustine in the CSF of rabbits suggests that borneol can improve the permeability of BBB.基金項目北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)專項經(jīng)費個人資助項目(編號:20061D0300415). 作者簡介：史衛(wèi)忠, 男, 碩士研究生 通訊作者：Keywords：

7、Nimustine(ACNU),Borneol, Blood Brain Barrier, High Performance Liquid Chromatogram, Pharmacokinetics尼莫司汀（Nimustine Hydrochloride，ACNU）是一種亞硝基脲類化療藥，具有高度的脂溶性和水溶性，靜脈注射后被完全吸收，生物利用度高，半衰期短，可通過血腦屏障，故對腦部腫瘤療效較好1。冰片具有增加血腦屏障通透性, 促進某些藥物 (如泛影葡胺、慶大霉素、順鉑等)透過血腦屏障進入腦組織的作用2-4。本文以日本大耳白兔為研究對象，比較冰片作用下尼莫司汀在血液和腦脊液中藥動學(xué)參數(shù)改變，

8、探討冰片對尼莫司汀透過血腦屏障的影響。1、實驗材料1.1 藥品與試劑天然冰片（吉安地區(qū)林科所天然冰片廠，批號：060804）；尼莫司汀標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma試劑公司，批號：015K1409）；對氨基苯甲酸（北京化學(xué)試劑公司，批號：070609）；烏拉坦（國藥集團化學(xué)試劑公司，批號：30191228）。1.2主要儀器島津高效液相色譜儀（LC-10ATvp泵、SPD-10Avp檢測器、SIL-10Advp自動進樣器、CTO-10Asvp柱溫箱）；超低溫冰箱（三洋電器）；低溫高速離心機(TGL-20M 高速臺式冷凍離心機)；氮吹儀(BF2000 氮氣吹干儀)；批pHS-3C精密PH計；電子天平(上海天平

9、儀器廠)。1.3實驗動物天壇醫(yī)院神經(jīng)外科動物室提供的日本大耳白兔（3.0±0.5kg） 16 只（北京科宇動物養(yǎng)殖中心，動物合格證號：SCXK 京200200005），雌雄兼用。2. 實驗方法2.1 實驗設(shè)計以冰片為開放血腦屏障的藥物，實驗動物隨機分為冰片組和對照組兩組。兩組均空腹8h，冰片組：冰片0.7g/kg (75%乙醇溶解) 灌胃，對照組：等量75%乙醇灌胃，1h 后冰片組開放血腦屏障，耳緣靜脈注射ACNU溶液，HPLC法測定血液、腦脊液中尼莫司汀濃度的變化，作為了解BBB促透性的參考指標(biāo)。2.2 實驗動物準(zhǔn)備稱取實驗兔體重，冰片組灌胃冰片0.7g/kg (75%乙醇溶解)，

10、對照組灌服等量75%乙醇，1h 后用預(yù)先配制的20%烏拉坦以58ml/kg 靜脈注射麻醉動物。根據(jù)實驗動物神志、肌張力、瞬目反射、對疼痛刺激的反應(yīng)等聯(lián)合判斷麻醉深度。兔肌張力減退、瞬目反射減弱、對疼痛刺激反應(yīng)遲鈍考慮麻醉適中。實驗兔以臥位固定于實驗臺上，枕頸部以肥皂水濕潤，剃刀剃毛。然后頭部前屈，安爾碘消毒枕頂部，血管穿刺針植入小腦延髓池（寰枕池），備取腦脊液；同時耳中央動脈血管穿刺針留置以備取血。2.3 樣品采集健康的日本大耳白兔隨機分為兩組，按“實驗動物準(zhǔn)備”項下操作，兩組均給予尼莫司汀4mg/kg 靜脈注射，分別在給藥的0min、5min、15min、30min、1h、2h、3h、5h取

11、血2.0ml 和腦脊液0.25ml 置于肝素化的離心管中，離心，分離血漿0.5ml、腦脊液0.2ml，加入內(nèi)標(biāo)50l血液，20l腦脊液，0.1molL HCl 酸化（鹽酸與樣品的比值為1：9），置-70°C 超低溫冰箱儲存?zhèn)溆谩?.4 溶液的配制和樣品的處理2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精密稱定尼莫司?。ˋCNU）對照品20.07mg，置于10ml 容量瓶中，加流動相甲醇-0.05M磷酸緩沖鹽（25：75，v/v）溶解并定容，搖勻，得濃度為2.0mg/ml 的ACNU溶液。通過適當(dāng)?shù)谋侗认♂屌渲瞥鰸舛确謩e為2000、1000、200、100、20、10、2g/ml 的系列儲備溶液，放置于

12、-70°C 低溫冰箱儲存。取上述系列儲備溶液25l置于離心管中，分別加入空白血漿、腦脊液475l，得到濃度為100、50、10、5、1、0.5、0.1g/ml的血液/腦脊液系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定。2.4.2 內(nèi)標(biāo)儲備液的配制精密稱定對氨基苯甲酸10.7mg，置于10ml 容量瓶中，加流動相甲醇-0.05M磷酸緩沖鹽（25：75，v/v）溶解并定容，搖勻，得濃度為1.0mg/ml 的對氨基苯甲酸溶液。通過適當(dāng)?shù)谋侗认♂屌渲瞥?00g/ml 的儲備溶液，放置于-70°C 低溫冰箱儲存。2.4.3 樣品預(yù)處理（1）血液樣品的處理取500l血漿，加入提取溶劑1，2-二氯乙

13、烷 5ml，渦流混合l min，往復(fù)振蕩10 min，離心，分取有機相于另一試管中，40°C 氮氣流下吹干，殘留物加入500l流動相溶解，渦流混合，以備進樣用。（2）腦脊液樣品的處理取腦脊液200l ，加入提取溶劑1，2-二氯乙烷 5ml，渦流混合l min，往復(fù)振蕩10 min，離心 5 min，分取有機相于另一試管中，40°C 氮氣流下吹干，殘留物加入200l流動相溶解，渦流混合，以備進樣用。2.5 尼莫司汀濃度測定5,6HPLC條件：以對氨基苯甲酸為內(nèi)標(biāo)，島津高效液相色譜儀（LC-10ATvp泵2個、SPD-10Avp檢測器、SIL-10Advp自動進樣器、CTO-1

14、0Asvp柱溫箱）；檢測波長：254nm；色譜柱：Kromasil C18 柱（5m，4.6mm×200mm）；流動相：甲醇-0.05M磷酸緩沖鹽（25：75，v/v）；流速：1ml/min；柱溫：25°C。2.5.1 系統(tǒng)專屬性試驗由于以流動性作為溶劑，尼莫司汀（ACNU）的保留時間為12.5min 左右，色譜圖的雜峰較少，沒有明顯的雜質(zhì)干擾；內(nèi)標(biāo)對氨基苯甲酸的峰在1011min 左右，兩者得到良好的分離（如圖13 所示）不影響尼莫司汀的測定。2.5.2 最低檢測限試驗取線性范圍的最低濃度0.1g/ml的樣品試液，經(jīng)處理后進樣檢測，信噪比S/N>5，知0.1g/ml

15、在最低檢測限之上。 A B C圖1 色譜圖A 空白血漿+內(nèi)標(biāo)；B 空白血漿+內(nèi)標(biāo)+ACNU；C 空白腦脊液+內(nèi)標(biāo)+ACNUFig 1 Chromatograms A. blank plasma wit h IS ; B. blank plasmas with IS and ACNU; C. blank CSF with IS and ACNU2.5.3 穩(wěn)定性試驗用0.1mol/L的氫氧化鈉、鹽酸溶液將流動相甲醇-0.05M磷酸緩沖鹽（25：75，v/v）g/ml的溶液。(1) pH值對ACNU穩(wěn)定性的影響將上述3組溶液在避光室溫的條件下放置。于0、1、2、4、8、12、24、48、72h時測

16、定各溶液的ACNU濃度。以0h濃度為 100%，計算其他時間的百分含量。以百分含量（%）為縱坐標(biāo)，時間（h）為橫坐標(biāo)做指數(shù)圖譜（圖4）。 可見，pH=7.0的一組溶液在室溫條件下迅速分解，而pH=3.0的ACNU溶液在三天后仍有約70%的含量。因此pH值越低，ACNU的穩(wěn)定性越好。在樣品處理時加入0.1M HCl可有效防止ACNU的分解。 圖2 pH值對ACNU穩(wěn)定性的影響 圖3 光照對ACNU穩(wěn)定性的影響Fig2 The effect of pH on the stability of ACNU Fig 3 The effect of light on the stability of AC

17、NU(2)光照對ACNU穩(wěn)定性的影響將pHpH可見，光照條件下ACNU分解速度加快，但pH調(diào)低又能對尼莫司汀的穩(wěn)定性起到積極的作用。 日內(nèi)日間精密度 取上述標(biāo)準(zhǔn)血液和腦脊液高中低3個濃度，1天內(nèi)進樣5次得日內(nèi)精密度，連續(xù)進樣5天得日間精密度。結(jié)果見表1。表1 樣品日內(nèi)日間精密度Tab 1 Result of precision濃度（g/ml）日內(nèi)RSD（%）日間RSD（%）血液0.51.362.7552.351.34501.241.91腦脊液0.50.674.6151.674.68500.353.51由上表可以看出，此方法的日內(nèi)和日間精密度都小于5%，符合要求。 回收率試驗 取高中低3個濃度的

18、標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按照前述處理方法，測定ACNU的絕對回收率和相對回收率。結(jié)果見表2.表2 樣品的絕對回收率和相對回收率Tab 2 Result of absolute recovery and relative recovery濃度（g/ml）絕對回收率（%）相對回收率（%）血液0.583.1998.67579.38100.355086.1797.64腦脊液0.579.68101.02580.16101.975084.6799.67由上表可以看出，此方法的絕對回收率約為80%，相對回收率在95%105%之間，符合要求。3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程 將已經(jīng)配置好濃度為100、50、10、5、1、0.

19、5、0.1g/ml的血液和腦脊液標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按照樣品處理項下的操作，進樣檢測。以尼莫司汀和內(nèi)標(biāo)對氨基苯甲酸的峰面積比值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為血液：y = 0.3149x + 0.6718，R2 = 0.9956；腦脊液：y = 0.2984x + 0.5616 R2 = 0.9973。結(jié)果表明：血液和腦脊液中ACNU在0.1-100g/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。4、結(jié)果4.1 藥時曲線 以時間為橫坐標(biāo)，各點平均濃度為縱坐標(biāo)，分別繪制ACNU在血液和腦脊液的藥時曲線（圖6）。圖4 ACNU藥時曲線圖Fig 4 Mean concentration-time curves

20、of ACNU4.2 重要藥代動力學(xué)參數(shù)比較 將上列各組的平均濃度和時間帶入藥動學(xué)軟件3P97進行擬合計算相關(guān)藥動學(xué)參數(shù)，比較重要參數(shù)（表34）表3 血液中ACNU各藥動參數(shù)比較Tab 3 Pharmacokinetic parameters of ACNU in plasma藥動學(xué)參數(shù)對照組冰片組Cmax（ug/ml）7.697.83AUC（ug·ml-1·h）6.817.24t1/2（h）0.570.58表4 腦脊液中ACNU各藥動參數(shù)比較Tab 4 Pharmacokinetic parameters of ACNU in plasma藥動學(xué)參數(shù)對照組冰片組Cmax（

21、g /ml）1.331.96Tmax（h）0.460.31AUC（g·ml-1·h）2.043.52t1/2（h）0.620.96ACNU具有高度的脂溶性，靜脈注射后迅速吸收，消除為一級指數(shù)反應(yīng)。對照組ACNU在腦脊液中的達峰時間為0.46h，最大峰濃度Cmax 為1.33g/ml。而冰片灌胃后，尼莫司汀在腦脊液中的達峰時間為0.31h，最大峰濃度Cmax 為1.96血藥濃度時間曲線下總面積AUC為3.52h和2.04h，可見冰片可見冰片促進血腦屏障開放，有助于藥物迅速通過BBB，增加尼莫司汀在腦脊液中的濃度，且能較長時間保持高濃度。以腦脊液和血液中ACNU比值計算血腦屏障

22、通透率，冰片組動物血腦屏障的平均通過率為48.62；對照組動物血腦屏障的平均通過率為29.96；二者具有顯著性差異（P0.05）說明冰片能夠有效增加尼莫司汀在腦脊液中的分布。而血液中ACNU對照組和冰片組ACNU的藥動學(xué)參數(shù)比較，統(tǒng)計學(xué)沒有差異，說明冰片不會增加ACNU在血液中的濃度。5.討論尼莫司汀是亞硝基脲類化療藥，不但具有高度的脂溶性還具有高度的水溶性。半衰期短，無需酶解作用，是較好的腦腫瘤化療藥物。瘤細(xì)胞對ACNU的敏感性隨瘤細(xì)胞的種類不同而各異，但ACNU抑瘤效應(yīng)具有劑量依賴性肯定，即使是很小的劑量提高亦是有效的。為了進一步提高瘤組織局部的ACNU藥量，取得更好的抑瘤效果，臨床上嘗試了很多方法。冰片是常用中藥,其促透作用早已為大量研究證明。本實驗以日本大耳白兔為研究對象，發(fā)現(xiàn)0.7g/kg冰片開放血腦屏障后，能增加尼莫司汀進入腦脊液的濃度，同時冰片并不增加ACNU在血液中的含量，因此不會增加藥物骨髓抑制等副作用，這為更經(jīng)濟、合理的使用ACNU提供了思路，減少用藥劑量，增加其在腦腫瘤組織局部的濃度，提高利用效率。本研究是以動物為模型，究竟作用于人體時冰片會不會增加ACNU對血腦屏障的透過率，有待于進一步研究證實。1 陳新謙，金有豫，湯光. 新編藥物學(xué)M . 第16 版. 北京:人民衛(wèi)生出版社,2007. 730.2 王寧生，梁美蓉，劉啟德，等.