高效微生物絮凝劑產(chǎn)生菌BJ_的篩選鑒定及絮凝特性研究_

1、文章編號:1008-1402(200902-0301-05高效微生物絮凝劑產(chǎn)生菌BJ -的篩選鑒定及絮凝特性研究李博,趙敏,彭元舉(東北林業(yè)大學,黑龍江哈爾濱150040摘要:從活性污泥中篩選出1株高效微生物絮凝劑產(chǎn)生菌B J -,其絮凝率達87.6%.通過生理生化分析及16S rDNA 序列鑒定該菌株為短芽孢桿菌(B acillus brevis .該菌產(chǎn)絮凝劑的最適碳源和氮源分別為20g L 的葡萄糖和2.0g L 的蛋白胨;適宜的初始pH 和培養(yǎng)溫度分別為7.0和30;在培養(yǎng)基中添加0.5g L 的Mg 2+有利于菌體生長,但對絮凝劑合成無影響.對該絮凝劑的特性研究結果表明:菌液投放量3

2、%、pH 值在59、溫度為60條件下絮凝效果最好,加入濃度為8%的Ca 2+可顯著提高其絮凝活性.實驗證明,該菌起絮凝作用的物質存在于發(fā)酵液中,主要成分為雜多糖.關鍵詞:微生物絮凝劑;絮凝率;鑒定;培養(yǎng)基優(yōu)化;絮凝特性中圖分類號:Q935文獻標識碼:A 微生物絮凝劑是微生物產(chǎn)生的一種有絮凝活性的代謝產(chǎn)物,是一類重要天然高分子絮凝劑,其分子量一般高于105,包括糖蛋白、多糖、蛋白質、纖維素和DNA 等不同物質,且具有廢水脫色的獨特效果1-4.微生物絮凝劑不僅具有高效、無毒、無二次污染、使用條件粗放等特點,而且其產(chǎn)生菌來源廣泛,種類多,因此是一類極具開發(fā)前途的水處理藥劑5-7.絮凝劑的研究工作已由

3、提純、改性,進入到利用生物技術培育、篩選優(yōu)良菌種,以較低的成本獲得高效絮凝劑的研究階段8-9.本文從活性污泥中篩選獲得一株具有較高絮凝活性的菌株B J -,并對其培養(yǎng)條件和絮凝特性進行了研究,以期提高該菌株合成的微生物絮凝劑的能力,開發(fā)具有針對性的高效微生物絮凝劑,既能明顯提高絮凝效果,還可大大降低絮凝劑投入量,從而降低處理成本.1材料與方法哈爾濱文昌污水處理廠活性污泥200g 放入1000m L 去離子水中,于磁力攪拌器上攪拌10min ,待固體沉淀后,1000r min 離心15min 收集上清(1牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(g L :牛肉膏3,蛋白胨10,NaCl 5,瓊脂20,pH7.0.(2

4、選擇培養(yǎng)基(g L :鄰苯二甲酸二丁脂(D BP 1.0,K 2HPO 40.6,MgS O 47H 2O 0.6,(NH 42S O 40.12,瓊脂15,pH6.8.(1分離與純化:取0.2m L 樣品于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基均勻涂布,再經(jīng)多次劃線分離純化可獲得多個純菌株.(2初篩和復篩:將純化后的菌種接種到50m L 基礎發(fā)酵培養(yǎng)基,在35,160r min 條件下振蕩培養(yǎng)72h.取2m L 發(fā)酵液、0.2g 高嶺土、1m L 1%CaCl 2水溶液,加水至50m L ,于磁力攪拌器上攪拌2min 攪拌,靜置觀察,選擇能產(chǎn)生絮狀沉淀并收稿日期:2008-12-10作者簡介:李博(1983

5、-,女,黑龍江哈爾濱人,東北林業(yè)大學生命科學學院,碩士研究生.第27卷第2期佳木斯大學學報(自然科學版V ol.27N o.22009年03月Journal of Jiamusi University (Natural Science Edition Mar.2009使懸濁液變清的菌株的發(fā)酵液進行下一步復篩.復篩結果以絮凝率作為表征參數(shù),以蒸餾水代替發(fā)酵液作對照,絮凝率計算公式如下:絮凝率=(A -B A ×100%(1細菌的培養(yǎng)形態(tài)及生理生化試驗細菌的培養(yǎng)形態(tài)及生理生化試驗參照文獻10.(2細菌DNA 的提取及PCR 擴增按傳統(tǒng)方法提取細菌基因組DNA 11.選擇16S rDNA

6、基因通用引物序列分別為:(5-C AG ATGGG AG CTT 2G CT CCCTG -3;5-CG ACTT C ACCCC AAT C AT CTG-3.PCR 反應條件為:94預變性5min ,94變性30s ,52退火30s ,72延伸1min ,30個循環(huán).絮凝活性的分布參照文獻12.分別改變發(fā)酵液投加量、pH 值、溫度和Ca 2+根據(jù)文獻13對微生物絮凝劑進行提取和精制.再分別應用紫外分光光度計(T U -1901在200nm 350nm 范圍,以及傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR -8400S 光譜儀在4000500(cm -1范圍內(nèi)對絮凝劑精品進行掃描,分析其主要成分.2結果

7、與討論2.1菌種篩選及鑒定共篩選獲得純培養(yǎng)45個菌株,選取一株絮凝活性穩(wěn)定并且絮凝率高達87.6%的菌株進行后續(xù)試驗研究,命名為B J -.菌株B J -呈桿狀,單個或成短鏈排列,革蘭氏陽性菌,有橢圓型芽孢.菌落扁平、光滑、呈乳白色.其生理生化特征見表1.獲得菌株B J -16S rDNA 擴增片段1559bp ,測序結果表明該序列與短芽孢桿菌的16S rDNA 序列有較高的同源性為99.3%,結合形態(tài)學和生理生化特征鑒定其為短芽孢桿菌屬(B acillusbrevis .表1菌株B J -生理生化特征試驗項目結果試驗項目結果革蘭氏染色+葡萄糖產(chǎn)氣-氧化酶-醋酸鹽利用+接觸酶+檸檬酸鹽利用+V

8、 -P-硝酸鹽利用-乳糖產(chǎn)酸+山梨醇產(chǎn)酸+甲基紅-甘露醇產(chǎn)酸+淀粉水解+明膠水解+“+”表示陽性,“-”表示陰性2.2菌株產(chǎn)生絮凝劑的培養(yǎng)條件優(yōu)化劑的影響分別以葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、乙醇、牛肉膏和甘油作為碳源,試驗結果如下:從菌體生長來看,葡萄糖最容易被利用,而在乙醇、牛肉膏和甘油為碳源時基本不生長;從絮凝活性來看,葡萄糖和蔗糖為碳源時菌株B J -絮凝率最高,分別達到86.7%和84.0%;而葡萄糖又是比較廉價易得的原料,所以選用葡萄糖.不同碳源濃度下試驗結果見圖1.當葡萄糖濃度在1525g L 時,絮凝率最高,當濃度繼續(xù)增加,絮凝活性出現(xiàn)下降的趨勢.從菌體生長來看,以20g L

9、的葡萄糖作為碳源時菌體濃度最高,過高或過低的糖濃度都不利于B J -生長,這是由于糖濃度過低不能提供足夠的能量和物質來源,而糖濃度過高會引起發(fā)酵液中滲透壓過高,使細胞失水生長受到抑制.考慮到成本因素,選擇最優(yōu)碳源濃度為20g L 的葡萄糖.圖1碳源濃度對菌株B J -生長及絮凝活性的影響的影響203佳木斯大學學報(自然科學版2009年分別以蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、大豆餅粉、尿素、K NO 3和(NH 42S O 4作為氮源,試驗結果表明:細菌B J -在尿素、K NO 3和(NH 42S O 4三種無機氮源中無法正常生長,而在有機氮源中生長狀況差別不大,其中以蛋白胨為氮源時菌株同時具有最高的

10、菌體濃度和高達90.2%的絮凝率,所以選擇蛋白胨為最佳氮源. L.圖2氮源濃度對菌株B J -生長及絮凝活性的影響分別在培養(yǎng)基中加入0.5g L 不同金屬離子,試驗結果見表2.金屬離子對絮凝活性的影響不大,但Mg2+,Ca2+,Na+,Fe 2+和K +對B J -生長有較強的促進作用,而A13+作為培養(yǎng)基組分.表2金屬離子對菌株B J -生長及絮凝活性的影響金屬離子菌體濃度(OD 600絮凝率(%2+0.5577.2該菌生長最適pH 值在7.5左右,過高或過低均不利于菌株生長,這是由于pH 值過低或過高都會引起微生物表面電荷的改變,從而不利于細胞對營養(yǎng)物質的吸收14.對于絮凝劑的產(chǎn)生,最適p

11、H值為6.0,此時絮凝率高達90%,這是由于該菌產(chǎn)物略呈酸性 .圖3初始pH 對菌株B J -生長及絮凝活性的影響在2030范圍內(nèi),隨著培養(yǎng)溫度的上升,菌株B J -的生長量和絮凝率都逐漸增加,而在30條件下,生物量和絮凝率均達到最大值,當溫度繼續(xù)升高時,生物量和絮凝率又同時呈逐漸下降的趨勢 .圖4培養(yǎng)溫度對菌株B J -生長及絮凝活性的影響2.3微生物絮凝劑絮凝特性的研究2.3.1絮凝活性的分布將菌株B J -在最適條件下160r min 振蕩培共設5個絮凝劑投加量梯度:1m L ,2m L ,3m L ,4m L 和5m L ,與其相對應的絮凝率分別為67.4%,77.9%,83.9%,7

12、4.2%和56.5%.由此可見,在低濃度范圍內(nèi)隨著絮凝劑濃度的提高,絮凝率隨之提高;但達到一定值后再增加絮凝劑的濃度,所形成的絮凝體會重新變成穩(wěn)定的膠體,絮凝率反而303第2期李博,等:高效微生物絮凝劑產(chǎn)生菌B J -的篩選鑒定及絮凝特性研究分別測定2m L發(fā)酵液對pH值為3,4,5,6,7, 8,9和10的100m L高嶺土懸濁液的絮凝率,對應結果為69.5%,73.3%,78.7%,84.8%,84.2%, 82.9%,77.7%和70.0%.試驗結果顯示,pH在5 9的范圍內(nèi),絮凝劑的絮凝效果都比較理想,可知該絮凝劑屬于非離子型絮凝劑,在酸堿情況下均能保持較好的絮凝效果,利于該菌株合成的

13、微生物絮凝劑的推廣和應用.設10個溫度梯度:10,20,30,40,50,60,70,80, 90和100(、考察該絮凝劑的熱穩(wěn)定性.結果表明,菌株B J-所合成的絮凝劑在1060范圍內(nèi)隨著溫度的升高絮凝活性逐漸增大,在3060范圍內(nèi)絮凝活性基本保持不變,以60為最佳條件.但當溫度超過60后,絮凝活性開始迅速下降,高嶺土懸濁液出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象.2.4絮凝劑有效成分的提取及鑒定應用干燥提取得到的絮凝劑粗品處理高嶺土懸濁液,絮凝率達89.9%.將此絮凝劑粗品進行層析,選擇波長490nm比色,結果如圖5所示:第3 10管出現(xiàn)主吸收峰,第3035管出現(xiàn)弱吸收峰.分別將310管、3035管分別進行混合,前者

14、絮凝活性達92.6%,而后者基本沒絮凝活性,因此可確定有效成分得到充分分離.最后將第310洗脫液混合后真空冷凍干燥,得到白色粉末即絮凝劑精制品,將此絮凝劑精品處理同樣高嶺土懸濁液,絮凝率為81.7%,其絮凝活性低于絮凝劑粗品,因此絮凝劑粗品具有實際應用價值 .圖5絮凝劑有效成分的硅膠柱層析圖譜分析絮凝劑精制品表征結果如下:該絮凝劑精品在205nm處出現(xiàn)唯一的強吸收峰,Amax絮凝劑精品經(jīng)紅外掃描結果如圖6所示, 3230,1640,1440和1040cm-1處的吸收峰是所有已知多糖類的特征峰.其中,3230cm-1是-OH伸縮振動的特征峰;1640cm-1和1440cm-1吸收峰分別是-C-O

15、-O非對稱伸縮振動和對稱伸縮振動引起的結果,表明有羧酸根離子存在;1040cm-1處是C-O-C和C-O-H兩種C-O的伸縮振動引起的吸收峰.綜上,精制絮凝劑的有效成份為酸性多糖,其表面活性基團有大量的-OH,-C OO-1,該絮凝劑為陰離子絮凝劑 .圖6絮凝劑精品紅外掃描圖譜3結論30、pH7.0,葡萄糖為20gL、蛋白胨為2.0gL,并添加0.5gL Mg2+的條件下生長良好.對影響絮凝作用的各種因素系統(tǒng)分析的結果表明:菌液投放量為3%,pH控制在59、溫度為60條件下絮凝效果最好,加入濃度為8%的Ca2+可顯著提高其絮凝活性.其后又對該菌株的發(fā)酵液分別進行了乙醇粗提和柱層析精提,得到微生

16、物絮凝劑粗品和403佳木斯大學學報(自然科學版2009年精制絮凝劑.研究表明絮凝劑粗品有實際應用價值,對高嶺土懸濁液的絮凝率高達92.6%.通過對精制絮凝劑進行了結構分析,發(fā)現(xiàn)該絮凝劑的有效成分為酸性多糖,且為陰離子絮凝劑.由此可見菌株B J -所合成的微生物絮凝劑具有絮凝率高、使用條件粗放的特點,所以具有一定的實際應用價值與發(fā)展前景.參考文獻:1辛寶平,莊源益,李彤.生物絮凝劑的研究和應用J .環(huán)境科學,1998,6(5:57-62.2李和平,鄭澤根,朱柱,等.微生物絮凝劑J .重慶環(huán)境科學,2000,1-21.3吳鍵,戴桂馥.微生物細胞的絮凝與微生物絮凝劑J .環(huán)境污染與防治,1994,1

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20、 -with a high capability of producing bio -flocculant was is olated from activated sludge of Sequencing Batch Reactor.Its flocculating efficiency could achieve 87.6%.The strain was identified as Ba 2cillus brevis based on its m orphological ,physio logical properties and 16S rDNA sequence analysis.This study showed that the optimum pH and tem per ature