蛋白質(zhì)組學(xué)和人類疾病的關(guān)系

1、蛋白質(zhì)組學(xué)和人類疾病的關(guān)系張  宇隨著基因組測序工作的進展，人們開始越來越關(guān)注一個問題，那就是所有這些基因編碼的蛋白的功能是什么？這個問題的提出使得蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)變得越來越重要。那么，什么是蛋白質(zhì)組學(xué)呢？這個概念最早是在1995年提出的，它在本質(zhì)上指的是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生、細胞代謝等過程的整體而全面的認識。目前，在蛋白質(zhì)功能方面的研究是極其缺乏的。大部分通過基因組測序而新發(fā)現(xiàn)的基因編碼的蛋白質(zhì)的功能都是未知的，而對那些已知功能的蛋白而言，它們的功能也

2、大多是通過同源基因功能類推等方法推測出來的。有人預(yù)測，人類基因組編碼的蛋白至少有一半是功能未知的。因此，在未來的幾年內(nèi)，隨著至少30種生物的基因組測序工作的完成，人們研究的重點必將轉(zhuǎn)到蛋白質(zhì)功能方面，而蛋白質(zhì)組的研究正可以完成這樣的目標(biāo)。在蛋白質(zhì)組的具體應(yīng)用方面，蛋白質(zhì)在疾病中的重要作用使得蛋白質(zhì)組學(xué)在人類疾病的研究中有著極為重要的價值。疾病的產(chǎn)生可能僅僅是因為基因組中一個堿基對的變化，如-血紅蛋白第六位上的Glu變?yōu)閂al就導(dǎo)致了鐮刀型細胞貧血癥的發(fā)生。然而，對于大多數(shù)疾病來說，其疾病發(fā)生機制要復(fù)雜的多。因此，對于疾病發(fā)生的分子機制的認識就需要一些能夠解決這些復(fù)雜性的方法來完成。而作為細胞中

3、的活性大分子，蛋白質(zhì)無疑是與疾病相關(guān)的主要分子，蛋白表達水平的改變是與疾病、藥物作用或毒素作用直接相關(guān)的。因此，基于蛋白質(zhì)整體水平的蛋白質(zhì)組學(xué)在人類疾病研究中無疑將發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)在，蛋白質(zhì)組學(xué)在人類疾病中的應(yīng)用已經(jīng)在一些疾病如皮膚病、癌癥、心臟病中廣泛開展了，而這些研究則主要集中在這樣幾個方面：尋找和疾病相關(guān)的單個蛋白，整體研究某種疾病引起的蛋白表達或修飾的變化，利用蛋白質(zhì)組尋找一些致病微生物引起的疾病的診斷標(biāo)記和疫苗等。下面，我們就將就蛋白質(zhì)組學(xué)的基本技術(shù)和這些領(lǐng)域的應(yīng)用作一些介紹。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基本技術(shù)對于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究來說，它的最基本的實驗手段就是利用雙向凝膠電泳(two-dime

4、nsional protein electrophoresis, 2DE)，在整個基因組水平上檢測蛋白質(zhì)表達的情況。雙向凝膠電泳首先利用等電點聚焦來分離不同等電點的蛋白，再利用SDS-PAGE來分離不同分子量的蛋白，其分辨率是非常高的。微克級的蛋白質(zhì)就可以被很好的分辨開了，如在微克級水平上，有人從一個蛋白混合物中最多分開了11200種蛋白質(zhì)，數(shù)量是非?？捎^的。因而，微克級的蛋白的雙向凝膠電泳常被用來初步檢測表達或修飾有變化的蛋白。然后，同樣的蛋白混合物樣品可用于毫克級的2DE，這樣，電泳圖譜上的每一個多肽就可被純化并進行下一步的分析，如質(zhì)譜、末端或中間的氨基酸序列

5、分析等。僅僅進行雙向凝膠電泳顯然是遠遠不夠的，因為由雙向電泳得到的蛋白質(zhì)表達情況的變化并不能和具體的何種蛋白表達出了變化聯(lián)系起來。而一些如蛋白質(zhì)印跡或凝集素親和印跡等傳統(tǒng)技術(shù)對于這方面的信息也幫助不大。為了鑒定這些由電泳得來的蛋白，質(zhì)譜(MS，mass spectrometry)被廣泛應(yīng)用在蛋白質(zhì)組學(xué)中。對于蛋白質(zhì)的鑒定，有兩種方法用的最為廣泛，即MALDI-MS ( matrix-assisted laser desorption ionization)和ESI-MS (electrospray ionization)。這

6、兩種方法各有自己的 適用范圍，通常前者對于分析高分子量的蛋白更有效，而后者對于蛋 白的檢測靈敏度更高，?？蛇_到飛克級水平以下。質(zhì)譜可以用于蛋白質(zhì)分析主要是因為它可以提供特定蛋白的不同方面的結(jié)構(gòu)信息，如它可直接測定蛋白或多肽的分子量信息，也可用來獲得一些蛋白質(zhì)序列信息等。同時，質(zhì)譜也可通過多肽片段分子量的改變來得到一些關(guān)于糖型，磷酸化和其它翻譯后修飾的數(shù)據(jù)。因此，質(zhì)譜對于蛋白質(zhì)的鑒定是非常重要的，而它的進展也無疑會大大促進蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進展。單個的疾病相關(guān)蛋白的尋找在疾病發(fā)生過程中，由于和疾病相關(guān)的遺傳信息的變化常常會導(dǎo)致蛋白的種類和數(shù)量發(fā)生變化，而這些變化是可以被高解析度

7、的雙向凝膠電泳所檢測到的，這就是利用蛋白質(zhì)組學(xué)尋找和鑒定疾病相關(guān)蛋白的依據(jù)。結(jié)腸癌的產(chǎn)生是一個包含了多個基因突變的多步過程，這其中包括抑癌基因的功能喪失，癌基因的活化等。然而，腫瘤發(fā)生的具體機制仍不清楚。對于這樣一種涉及多種蛋白的疾病，人們已經(jīng)開始利用蛋白質(zhì)組學(xué)來分析結(jié)腸粘膜發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化后的多肽的變化了。對照15例結(jié)腸癌病人和13例正常人的結(jié)腸表皮的雙向凝膠電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者分別含有882個和861個點，而這些點中，有一個蛋白，其分子量為 13kDa，等電點為5.6，它只在腫瘤組織中專一性的表達。在15個癌癥樣品中，有13例的此蛋白表達上調(diào)，占到了87%。進一步的研究也證實了這個蛋白

8、在不同程度的癌癥引起的發(fā)育異常中也有明顯的表達水平上的差異。由雙向電泳發(fā)現(xiàn)的這個可能與癌癥相關(guān)的蛋白到底是什么蛋白呢？從電泳的凝膠上得到的這個點經(jīng)胰蛋白酶水解后，得到的肽段由-HPLC分離后測序。測序的結(jié)果拿到兩個序列，LGHPDTLNQ和VIEHMEDLDTNADK，這與鈣粒蛋白B的情況完全吻合。進一步的用MALDI-MS分析的結(jié)果也證實了這個蛋白就是鈣粒蛋白B。同時，結(jié)合以前的發(fā)現(xiàn)，即由鈣粒蛋白B和A組成的異源二聚體蛋白鈣防衛(wèi)蛋白在胃腸腫瘤病人的糞便樣品中含量有很大提高，鈣粒蛋白B在腫瘤性轉(zhuǎn)化的組織中的高專一性存在顯示出它在結(jié)腸癌的產(chǎn)生中具有重要的作用。盡管蛋白的具體功能還需要進一步的闡明

9、，但這個例子已經(jīng)可以證明，由蛋白質(zhì)組學(xué)方法尋找疾病相關(guān)蛋白肯定是可行的。這方面的另一個例子是關(guān)于肝細胞癌的研究。雙向凝膠電泳已經(jīng)被成功的用于發(fā)現(xiàn)化學(xué)誘導(dǎo)的鼠的肝癌相關(guān)蛋白中。而雙向電泳和蛋白質(zhì)化學(xué)方法的聯(lián)合應(yīng)用也更深化了對這些癌癥相關(guān)蛋白的具體特征的認識。在用N-甲基-N-亞硝基脲誘導(dǎo)了鼠的肝癌后，利用雙向電泳發(fā)現(xiàn)了一些表達有變化的蛋白，經(jīng)氨基酸序列分析后，分析其中一個蛋白是來源于肝癌的醛糖還原酶樣蛋白( hepatoma-derived aldose reductase-like protein)。這個蛋白分子量為35KDa，等電點為7.4，它是

10、60;一種在肝癌和胚胎的肝中特異性表達的蛋白。利用雙向電泳得到了這樣一種可能和癌癥相關(guān)的蛋白后，一些蛋白質(zhì)化學(xué)的方法可用來對這種蛋白和疾病的相關(guān)性作進一步的研究。有人利用免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)，直接針對來源于肝癌的醛糖還原酶樣蛋白的抗體FR-1表明，這個蛋白在化學(xué)誘導(dǎo)的肝癌小鼠的發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)化的前期和轉(zhuǎn)化的早期就已經(jīng)有很強的表達了，而正常肝組織中并無表達。這都是該蛋白涉及肝癌發(fā)生過程的有力證據(jù)。已有的一些關(guān)于此蛋白的研究表明，醛糖還原酶是還原酶超家族的成員，在山梨糖醇途徑中它可以催化葡萄糖向山梨糖醇的轉(zhuǎn)化，而且在一些糖尿病的并發(fā)癥的發(fā)生中它也有作用。作為一種酶，它可以水解一些生物異源物質(zhì)等，因此它也

11、參與了一些解毒過程。而在肝癌發(fā)生過程中，一些解毒酶的表達水平或活力增高已是公認的事實了。對于醛糖還原酶這一類有解毒功能的蛋白來說，只有由雙向電泳發(fā)現(xiàn)的肝癌來源的醛糖還原酶樣蛋白是與肝癌相關(guān)的。它首先在胚胎肝中表達，但在成年的肝中就不表達了。肝癌發(fā)生時，它又重新表達了。因此，目前可以初步推斷，醛糖還原酶樣蛋白在肝癌發(fā)生過程中是與肝的解毒過程相關(guān)的?，F(xiàn)在，在人的肝癌中，也找到了鼠的醛糖還原酶樣蛋白的同源蛋白，它同樣是在人的不同組織中選擇性表達的。疾病相關(guān)蛋白的整體研究對于大多數(shù)疾病來說，疾病造成的往往不只一個或幾個蛋白的變化，參與疾病過程的蛋白的數(shù)目也是很大的，因此除了通過雙向凝膠電泳來尋找與疾病

12、相關(guān)的單個蛋白外，通過蛋白質(zhì)組對表達情況有變化的蛋白在整體水平上的研究同樣是非常重要的。目前，在利用雙向凝膠電泳進行的蛋白整體水平的研究方面，擴張性的心肌病(Dilated cardiomyopathy, DCM)是一個較好的例子。擴張性的心肌病是一種嚴重的心臟疾病，對于這種疾病的致病機理和涉及的分子都還不清楚，而且，對于這樣一種復(fù)雜的疾病來說，也不可能僅由一種致病機理造成。因此，對于這樣的疾病，從整體的蛋白質(zhì)組水平來研究是極為必要的。另外，相對其它組織而言，主要由心肌細胞組成的心臟是一種相對均一的組織，這也為用雙向凝膠電泳進行蛋白質(zhì)組的研究提供了良好的基礎(chǔ)。對DCM的蛋白

13、質(zhì)組的研究在九十年代初就已經(jīng)開始了，目前，心肌的雙向凝膠電泳的數(shù)據(jù)庫已經(jīng)建立。盡管國際上各實驗室之間的數(shù)據(jù)之間有著如不同的樣品制備，不同的等電聚焦條件，不同的凝膠大小等差異，但這些數(shù)據(jù)的比較證明，在大多數(shù)情況下，不同蛋白的點的位置還是相對穩(wěn)定的，可以進行大規(guī)模的比較研究。在Knecht等人的研究中，得到了一個高解析度的具有大約3300個心肌蛋白點的雙向電泳結(jié)果，并對其中的150個蛋白進行了氨基酸分析，N端和中間的Edman降解以及MALDI-MS等一系列鑒定。而對幾百個正常和擴張性心肌病的病人的2-DE結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，兩者的蛋白條帶具有可比性。除去一些可能由不同的疾病有關(guān)參數(shù)如患病程度，用藥情況

14、，病人年紀(jì)等因素造成的無重復(fù)性的點的多少和強度的變化外，患病者和正常人有25種蛋白在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著差異。這些即是DCM相關(guān)蛋白。而這個結(jié)果是在對幾百個樣品的大規(guī)模研究的基礎(chǔ)上得來的，而也只有大規(guī)模的研究，才能體現(xiàn)出這個結(jié)果在實際應(yīng)用前景上的價值。對于這幾十種疾病相關(guān)蛋白，我們可以用一些其它方法，如免疫組化、酶活測定等來作進一步的鑒定，確認它們與疾病的相關(guān)性以及它們在疾病中的作用等。這些工作都是在基于蛋白質(zhì)組的研究基礎(chǔ)上進一步的深入而進行的，顯然，在幾百個DCM患者和正常對照的樣品的大規(guī)模水平上對疾病相關(guān)蛋白的整體研究無疑是最為基礎(chǔ)和有效的。病原微生物的蛋白質(zhì)組學(xué)分析近幾年來，關(guān)于傳染病的研究

15、變得比原來更為重要。一些新的傳染原，如Borrelia burgdorferi、HIV、Ebola病毒等的出現(xiàn)，使得一些原來認為已被控制的疾病如結(jié)核，多抗藥性的鏈球菌屬感染等又有所增 加，有些有免疫力的微生物和病毒進行蛋白質(zhì)組學(xué)的分析就顯得非常必要，它可以用來尋找抗原、疫苗等，而這些對于疾病的診斷、治療和防治是極為重要的。目前，已知?8種微生物的基因組測序已經(jīng)完成，而另有60多種的微生物的基因組測序正在進行當(dāng)中，這些基因序列的信息和相對真核組織來說少得多的基因數(shù)量都為蛋白質(zhì)組的研究提供了良好的基礎(chǔ)。疏螺旋體屬的Borrelia burgdoferi是引起多系統(tǒng)疾病

16、人類Lyme氏疏 螺旋體病的主要致病因子。這種疾病的癥狀開始時常表現(xiàn)為一些環(huán)狀紅斑樣皮疹以及流感樣癥狀，發(fā)展下去也會造成一些神經(jīng)系統(tǒng)的并發(fā)癥和關(guān)節(jié)炎等。目前，對這種疾病的診斷主要是通過臨床癥狀的判斷并輔以血清學(xué)實驗如ELISA、免疫印跡等來證實。由于這些實驗具有不同程度的敏感性和特異性，診斷并不是標(biāo)準(zhǔn)化的。利用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供一些新的較為標(biāo)準(zhǔn)的診斷標(biāo)記就顯得尤為必要了。Borrelia burgdoferi的染色體上有853個基因，它的11個質(zhì)粒上有額 外的430個基因。它的雙向凝膠電泳圖譜大約有300個點，由這些蛋白點就可以尋找免疫相關(guān)抗體等蛋白了。將銀染的

17、 Borrelia burgdoferi的 2DE凝膠上的其中217個點編號后，用來源于兔子的多克隆抗體采用免 疫雜交的方法鑒定了一些抗原在膠上的位置，如外表面蛋白A(OspA)、OspB、OspC、p83/100、p39和flagellin p41等。除了p83/100外，所有 抗原在2DE圖上都存在于不只一個點上。利用不同表現(xiàn)癥狀的Lyme氏 疏螺旋體病病人的血清與疏螺旋體的2DE圖進行印跡分析發(fā)現(xiàn)，具有 紅斑遷移癥狀的十個病人的血清中分別含有60種和88種抗原的IgM型和IgG型抗體，而關(guān)節(jié)炎病人的血清中含有

18、15種抗原的IgM抗體和76種不同抗原的IgG抗體，晚期神經(jīng)疏螺旋體病人的血清中則含有33種抗原的IgM抗體和76種抗原的IgG抗體，但在這三種不同疾病時期的病人血清中都含有這樣幾種抗原的抗體,OspA、OspB、OspC、flagellin、p83/100、p39等，這幾個抗原同時也是原來血清學(xué)實驗中用來診斷的標(biāo)記，蛋白質(zhì)組的結(jié)果驗證了原來診斷的合理性，同時，2DE的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)了一些原來并沒有發(fā)現(xiàn)的抗原，這些正是一些新的潛在的診斷標(biāo)記。更多診斷標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)對于診斷的標(biāo)準(zhǔn)化和準(zhǔn)確性的提高大有幫助。弓形蟲病是由原生動物Toxoplasma gondil寄生感染引起的，全世 界約

19、有30%的人攜帶此種寄生蟲，而在歐洲，弓形蟲病是發(fā)生頻率最 高的傳染病之一，因此，這種疾病的危害是相當(dāng)高的。在健康人群中，寄生蟲的感染通常是無癥狀的或癥狀極其輕微的，但如果是懷孕期間感染，寄生蟲就會通過胎盤，并造成胎兒的死亡。隨著懷孕時間的增加，寄生蟲穿透的可能性也會增加。因此，確定感染的時間就顯得非常重要了。另一方面，懷孕不同時期的感染后果也是不同的，在懷孕早期，器官形成過程時的感染危害可能是致死的，而懷孕的后期，胎兒的感染經(jīng)常會導(dǎo)致一些并發(fā)癥的出現(xiàn)如視網(wǎng)膜色素異常等。如果在懷孕期間感染的婦女得到了充分的治療，胎兒感染的可能和后果的嚴重性都會大大降低。因此，及時的診斷和準(zhǔn)確判斷感染

20、時間對于弓形蟲病的治療是非常重要的。 但實際上，90%以上的懷孕婦女的初期感染都不能被及時發(fā)現(xiàn)。目前的診斷主要是依靠血清學(xué)手段和PCR方法，而用血清學(xué)的方法來檢測抗體對于一些無免疫應(yīng)答的和懷孕的病人顯然是不夠的，而潛伏性感染致病恰恰是經(jīng)常發(fā)生在無免疫應(yīng)答的人中。如在艾滋病患者中， T.gondil就是導(dǎo)致腦內(nèi)病變并致死的主要原因。由這些都可看出，疾病的有效的診斷對于有效的治療是非常關(guān)鍵的。同樣，蛋白質(zhì)組水平上的研究為這方面的進展提供了非常有力的方法。我們可以用不同感染情況的病人的血清和T.gondil的2DE圖進行免疫印跡來尋找和感染相關(guān)的抗 原來作為診斷標(biāo)記。這

21、些不同的血清包括：急性感染弓形蟲病的懷孕婦女的血清、急性弓形蟲病的非懷孕病人的血清、潛伏性感染弓形蟲的尚未發(fā)病者的血清。結(jié)果顯示，2DE圖上的9個點可以和感染者血清中的任一類型的免疫球蛋白反應(yīng)，且這種反應(yīng)和感染的狀態(tài)和發(fā)病與否無關(guān)，這9個點就可用來作為T.gondil 感染的標(biāo)記。另外有7個點 和抗體的反應(yīng)則與抗體類型或發(fā)病情況有關(guān)，可用來區(qū)分不同疾病狀況如潛伏期和急性期等，它們同樣可作為進一步判斷感染狀態(tài)的診斷標(biāo)記使用。小結(jié)雙向凝膠電泳就象一個分子顯微鏡，將復(fù)雜的蛋白混合物分離開來，而進一步的由疾病和對照的比較可以找到一些疾病相關(guān)蛋白。目前，蛋白質(zhì)組的應(yīng)用最多的領(lǐng)域就是通

22、過疾病和對照的2DE條帶的比較尋找單個的疾病相關(guān)蛋白，鈣粒蛋白B在結(jié)腸癌中的表達上調(diào)和肝癌來源的醛糖還原酶樣蛋白在鼠的肝癌發(fā)生過程中的重新表達就是兩個典型的例子。這些蛋白和疾病的相互關(guān)系還可以通過免疫組化等方法進一步的鑒定。而另一方面，利用蛋白質(zhì)組來進行整體水平上的研究也是不可缺少的。如對擴張性心肌病的研究就顯示出了患病者和對照的 25種蛋白的顯著差異，人的心肌的包括了3300個蛋白的雙向凝膠電泳數(shù)據(jù)庫也已經(jīng)建立了。對于整體水平上的研究而言，規(guī)模越大，使用樣品數(shù)目越多，對分子機制的研究可能就越深入，因而國際間的協(xié)作是非常重要的。蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用的另一領(lǐng)域是在致病微生物的診斷用蛋白的尋找

23、方面，如在上面所提到的Borrelia burgdoferi引起的Lyme氏 疏螺旋體病和Toxoplasma gondil引起的弓形蟲病等，由蛋白質(zhì)組學(xué)得 來的診斷標(biāo)記甚至還可用來區(qū)分不同的疾病時期，這些都為有效的診斷檢測的發(fā)展提供了基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究在蛋白質(zhì)功能和人類疾病研究方面為我們開辟了一個新的領(lǐng)域，盡管它還處于剛剛起步的不成熟期，很多技術(shù)還有待完善和發(fā)展，但它的潛力是不可低估的，在將來，蛋白質(zhì)組在人類疾病中的應(yīng)用也必然會更加廣泛和深入。參考文獻1 Dutt MJ, Lee KH: Proteomic analysis. Curr opin Biotechnol 2000,11(2):176-1792 Jungblut PR, Zimny-Arndt U, Zeindl-Eberhart E: Proteomics in human disease: Cancer, Heart