褪黑素替代治療后去松果體大鼠學(xué)習(xí)記憶及側(cè)腦室室管膜下區(qū)神經(jīng)干細胞增殖的變化

1、褪黑素替代治療后去松果體大鼠學(xué)習(xí)記憶及側(cè)腦室室管膜下區(qū)神經(jīng)干細胞增殖的變化*         06-06-30 09:35:00     編輯：studa20郭 靈，林 丹，曾慶堂，鄧祥發(fā)，崔衛(wèi)剛，韋 力，磨潔琳，藍 玲                     

2、0;    【摘要】  目的  觀察褪黑素替代治療對去松果體成年大鼠學(xué)習(xí)記憶及側(cè)腦室室管膜下區(qū)（SVZ）神經(jīng)干細胞增殖的影響。方法  將30只健康雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分為假手術(shù)、去松果體及褪黑素替代治療3組，每組大鼠10只。在建立動物模型2天后開始用褪黑素（200g/kg體重）或5%乙醇-生理鹽水進行干預(yù)，每天在固定時間給予每只大鼠腹腔注射1次，連續(xù)給藥21天。各組均于術(shù)后第16天開始用Morris水迷宮連續(xù)5天測定大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，用免疫組織化學(xué)方法觀察SVZ的增殖細胞核抗原（PCNA）陽性細胞變化。結(jié)果

3、60; 去松果體組大鼠在Morris水迷宮游泳的逃避潛伏期及在原平臺象限游泳距離的百分比明顯延長或減少（P0.01）。去松果體大鼠SVZ的PCNA陽性細胞核數(shù)也明顯下降（P0.01）。褪黑素替代治療后可明顯逆轉(zhuǎn)上述指標(biāo)的變化，并使其接近假手術(shù)組大鼠的水平（P0.01）。假手術(shù)組與褪黑素替代治療組間的指標(biāo)差異無顯著性（P0.05）。結(jié)論  本研究首次觀察到，去松果體使體內(nèi)褪黑素減少，可導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能及SVZ神經(jīng)干細胞增殖能力出現(xiàn)相似的明顯下降趨勢，褪黑素替代治療后可使上述指標(biāo)出現(xiàn)相似的明顯升高趨勢并接近正常水平。說明褪黑素是確保學(xué)習(xí)記憶及神經(jīng)發(fā)生得以正常進行的重要激素之一；提示褪黑素

4、可能通過作用于局部神經(jīng)干細胞以及星形膠質(zhì)細胞上的相應(yīng)受體的機制來促進神經(jīng)干細胞增殖，使SVZ-吻側(cè)遷移途徑-嗅球的神經(jīng)發(fā)生鏈在結(jié)構(gòu)和功能上得到不斷更新，進而提高學(xué)習(xí)記憶能力。        【關(guān)鍵詞】  松果體； 褪黑素；替代治療；學(xué)習(xí)記憶；室管膜下區(qū)；神經(jīng)干細胞；增殖；大鼠               【Abstract】  Objective  To invest

5、igate the effects of melatonin replacement therapy on the learning and memory as well as on the proliferation of neural stem cells in the subventricular zone（SVZ） of the lateral ventricle in pinealectomized adult rats.Methods  Thirty male Sprague-Dawely rats were randomly divided into three gro

6、ups with ten rats per group： sham-operated，pinealectomized and melatonin-replacement therapy. After two days of operations，the rats in melatonin-replacement therapy group received daily peritoneal injection of melatonin（ 200g/kg body weight，dissolved  in 5ml of 5% ethanol-NaCl solution）for twen

7、ty one consecutive days; while the rats in sham-operated and pinealectomized groups were daily given the equal volume of vehicle under the same conditions. After sixteen days of operations，the rat performences in Morris water maze were detected for five consecutive days. Then the number of prolifera

8、ting cell nuclear antigen immunoreactive （PCNA-IR） cell nuclei in the SVZ was counted.Results  Navigation tests showed that the escape latency for finding the platform during training trials of pinealectomized rats was significantly longer than that of sham-operated or melatonin-replacement rat

9、s （P0.01）. Probe tests revealed that pinealeetomized rats had much worse knowledge of the platforms prcise location  than sham-operated or melatonin-replacement rats did （P0.01）. Similarly，the mumber of PCNA-IR cell nuclei in the SVZ of pinealectomized rats was significantly lower than that in

10、sham-operated or melatonin-replacement rats （P0.01）. However，melatonin replacement therapy reversed the above parameters（P0.01），which nearly reached the levels of sham-operated rats（P0.05）.Conclusion  The data for the first time demonstrate that pinealectomy reduces the level of endogenous mela

11、tonin，and impairs the learming and memory processes as well as the proliferation of neural stem cells in the SVZ，whereas exogenous melatonin replacement therapy can reverse these changes，indicating that melatonin plays an important role in maitaining the normal learning and memory processes as well

12、as in augmenting the neurogenesis in SVZ; and that melatonin may promote the neurogenesis in SVZ via activation of melatonin receptors in both neural stem cells and astrocytes，thereby enhancing olfactary memory.            哺乳動物側(cè)腦室室管膜下區(qū)（subventri

13、cular zone ，SVZ）是腦內(nèi)終生存在神經(jīng)發(fā)生（neurogenesis）的一個主要部位，由此產(chǎn)生的神經(jīng)干細胞通過有絲分裂形成祖細胞（progenitor cell），后者遷移到嗅球，分化成新的中間神經(jīng)元，代替衰老或死亡的神經(jīng)細胞，使局部神經(jīng)環(huán)路的結(jié)構(gòu)得到不斷更新，從而發(fā)揮正常的嗅覺及嗅覺記憶功能1。褪黑素是主要由松果體合成和分泌的一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，已證實其不僅具有促進胚胎個體發(fā)育及體外培養(yǎng)神經(jīng)干細胞增殖的功能2，3，而且還可提高學(xué)習(xí)記憶能力4。然而，迄今仍匱乏有關(guān)褪黑素對成年在體SVZ神經(jīng)發(fā)生及學(xué)習(xí)記憶影響的報道。為此，筆者最近進行了研究并初步觀察到，松果體切除對成年大鼠SVZ神經(jīng)

14、發(fā)生及學(xué)習(xí)記憶均產(chǎn)生類似的負性效應(yīng)5。為進一步揭示褪黑素、神經(jīng)干細胞及學(xué)習(xí)記憶三者之間的內(nèi)在聯(lián)系，本研究通過觀察褪黑素替代治療對上述指標(biāo)的影響模式，為闡明學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)內(nèi)分泌機制提供新的資料。        1  材料與方法        1.1  主要試劑  小鼠抗人PCNA單克隆抗體為DAKO公司產(chǎn)品；生物素結(jié)合IgG、鏈霉菌抗生物素-過氧化酶（SP）及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色試劑盒均為福州邁新公司產(chǎn)品；褪黑素為Sigma公司產(chǎn)品。

15、60;       1.2  動物與分組  選用清潔級健康雄性Sprague-Dawely大鼠30只，810周齡，體重150180g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。將大鼠隨機分為以下3組，每組10只：假手術(shù)、去松果體及褪黑素替代治療組。        1.3  動物模型的建立  參照袁群芳等的方法4，進行松果體切除術(shù)，假手術(shù)除不切除松果體外，其余步驟與上述相同。所有動物在自然光暗周期的環(huán)境中分組飼養(yǎng)，自由飲水、進食。  &#

16、160;     1.4  替代治療方法  術(shù)后第2天開始進行相應(yīng)的干預(yù)，褪黑素替代治療組的每只大鼠按200g/kg 劑量將褪黑素溶于0.5ml的5%（V/V）乙醇-生理鹽水中，每天在固定時間（18：00 pm）腹腔注射1次，連續(xù)給藥21天。在相同條件下，每天給予假手術(shù)組和去松果體組的每只大鼠腹腔注射0.5ml的5%乙醇-生理鹽水，連續(xù)注射21天。        1.5  學(xué)習(xí)記憶能力的測定         

17、; 定位航行實驗  于術(shù)后16天開始用Morris水迷宮（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制，型號：DMS-2）測試，歷時4.5天，每天分上、下午2個時段，每只大鼠在每個時段測試4次，記錄大鼠每次自入水直至找到并爬上平臺所需的時間，即逃避潛伏期，如60s找不到平臺即記錄為60s，以此作為判斷大鼠學(xué)習(xí)能力的指標(biāo)。          空間探索實驗  在測試的第5天下午撤走平臺，將大鼠放入水中，通過電腦測試系統(tǒng)記錄大鼠在2min內(nèi)的游泳軌跡，計算出大鼠在原平臺象限的游泳距離占總游泳距離的百分比，以此作為判斷大鼠記憶能

18、力的指標(biāo)。        1.61.7  免疫組化反應(yīng)  采用SP法檢測SVZ的增殖細胞核抗原（proliferating cell nucleus antigen，PCNA）的表達，主要步驟如下：切片入3%（V/V）H2O2溶液室溫15min，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；入0.1%（V/V）Triton X-100溶液（0.01 mol/L PBS配，pH 7.4）室溫孵育1h；正常羊血清室溫封閉抗原20min；小鼠抗人PCNA單克隆抗體（1:100）室溫孵育22h；生物素結(jié)合IgG室溫孵育2h；SP室溫孵育2h；0.05%DAB（含0.01%（V/V）H2O2）室溫顯色約30s。在上述過程中，完成每一步驟后均用0.01mol/L PBS（pH 7.4）漂洗15min，然后再進行下一步驟。常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。陰性對照實驗除用羊血清代一抗外，其余步驟與上述相同。        1.8  細胞計數(shù)  每只動物選取3張切片（前囟前0.8mm、1.0mm、1.2mm）作為觀察對象6，光鏡下（40×10）計數(shù)左側(cè)側(cè)腦室SVZ的背側(cè)、外側(cè)及內(nèi)側(cè)3個視野的PCNA陽性細胞數(shù)。 &