3新型液相色譜簡(jiǎn)介

1、儀器分析課程講義儀器分析課程講義第五節(jié)第五節(jié) 高效液相色譜法的應(yīng)用高效液相色譜法的應(yīng)用氨基酸自動(dòng)分析儀氨基酸自動(dòng)分析儀amino acid autoanalyzer,aaaamino acid autoanalyzer,aaa制備色譜制備色譜：以色譜技術(shù)來(lái)分離、制備較大以色譜技術(shù)來(lái)分離、制備較大量純組分的方法，量純組分的方法，結(jié)構(gòu)與分析型一樣，但結(jié)構(gòu)與分析型一樣，但采用大流量輸液泵、采用大流量輸液泵、制備柱、制備柱、柱后餾分收柱后餾分收集器（按照固定體積順序收集組分）。集器（按照固定體積順序收集組分）。 應(yīng)用應(yīng)用：制備標(biāo)準(zhǔn)物；對(duì)有機(jī)復(fù)雜組分進(jìn)行：制備標(biāo)準(zhǔn)物；對(duì)有機(jī)復(fù)雜組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定分析。結(jié)構(gòu)

2、鑒定分析。2.2.色譜柱的柱容量（柱負(fù)荷）色譜柱的柱容量（柱負(fù)荷） 1.1.概述概述 超臨界流體超臨界流體： 冷凍裝置：冷凍裝置：超臨界流體從流體源出來(lái)后，超臨界流體從流體源出來(lái)后，經(jīng)冷凍裝置預(yù)冷卻成液體，再進(jìn)行壓力經(jīng)冷凍裝置預(yù)冷卻成液體，再進(jìn)行壓力和溫度的平衡，形成超臨界流體。和溫度的平衡，形成超臨界流體。 檢測(cè)器：檢測(cè)器：可用氣相色譜和液相色譜的檢可用氣相色譜和液相色譜的檢測(cè)器，但超臨界流體進(jìn)入檢測(cè)器之前需測(cè)器，但超臨界流體進(jìn)入檢測(cè)器之前需轉(zhuǎn)變成為氣體或液體。轉(zhuǎn)變成為氣體或液體。第六節(jié)第六節(jié) 氨基酸自動(dòng)分析儀氨基酸自動(dòng)分析儀 高速氨基酸分析儀高速氨基酸分析儀的實(shí)質(zhì)是一臺(tái)專(zhuān)用的高的實(shí)質(zhì)是一臺(tái)

3、專(zhuān)用的高效液相色譜儀，所用的類(lèi)型是離子交換色效液相色譜儀，所用的類(lèi)型是離子交換色譜法。譜法。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：分析時(shí)間縮短；分析時(shí)間縮短； 精確度越來(lái)越高；精確度越來(lái)越高； 完全實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。完全實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。一、固定相和流動(dòng)相一、固定相和流動(dòng)相1 1固定相固定相：強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂：強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂 磺酸型磺酸型 soso3 3nana氨基酸與樹(shù)脂的親和力：氨基酸與樹(shù)脂的親和力： 堿性氨基酸中性氨基酸堿性氨基酸中性氨基酸 酸性氨基酸酸性氨基酸 氨基酸自動(dòng)分析儀出峰次序?yàn)椋喊被嶙詣?dòng)分析儀出峰次序?yàn)椋?asp asp thrthr ser ser gluglu pro pro glygly al

4、a ala cyscys val val met met ileile leuleu tyrtyr phephe lye lye nh3 nh3 his his argarg 酸性氨基酸中性氨基酸酸性氨基酸中性氨基酸 堿性氨基酸堿性氨基酸在同類(lèi)型氨基酸中，在同類(lèi)型氨基酸中，短碳鏈短碳鏈的小分子先洗的小分子先洗脫下來(lái)，脫下來(lái)，長(zhǎng)碳鏈長(zhǎng)碳鏈的大分子后洗脫下來(lái)。的大分子后洗脫下來(lái)。如如 g1y 和和ala ， val和和leu 。對(duì)碳數(shù)相同的氨基酸，對(duì)碳數(shù)相同的氨基酸，有支鏈有支鏈的先流出，的先流出，無(wú)支鏈無(wú)支鏈的后流出。如的后流出。如 i1e 和和1eu 。碳鏈上存在碳鏈上存在羥基羥基可加速洗脫。

5、如可加速洗脫。如 ser和和a1a， tyr和和phe 。2 2流動(dòng)相流動(dòng)相 na na型型：檸檬酸的鈉鹽：檸檬酸的鈉鹽 標(biāo)準(zhǔn)分析標(biāo)準(zhǔn)分析 （蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物分析）（蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物分析） lili型型：檸檬酸的鋰鹽：檸檬酸的鋰鹽 生理體液（尿、血漿、組織提取液）生理體液（尿、血漿、組織提取液） 通過(guò)改變緩沖液的通過(guò)改變緩沖液的phph，離子強(qiáng)度，加有機(jī)溶，離子強(qiáng)度，加有機(jī)溶劑可改善部分峰分離。劑可改善部分峰分離。 二、氨基酸分析儀的結(jié)構(gòu)二、氨基酸分析儀的結(jié)構(gòu) 輸液系統(tǒng)輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)記錄系統(tǒng)記錄系統(tǒng) 1 1輸液泵輸液泵：雙泵，：雙泵，分別輸送流動(dòng)相和分別輸

6、送流動(dòng)相和茚茚 三酮溶液三酮溶液 。 2 2進(jìn)樣器進(jìn)樣器3 3分離柱分離柱 玻璃管或不銹鋼管，玻璃管或不銹鋼管， 柱溫：柱溫：適當(dāng)改變柱溫可以改善某些峰適當(dāng)改變柱溫可以改善某些峰的分離效果。的分離效果。 柱長(zhǎng)與內(nèi)徑柱長(zhǎng)與內(nèi)徑 ：與固定相顆粒大小有關(guān)。與固定相顆粒大小有關(guān)。4反應(yīng)器反應(yīng)器氨基酸與茚三酮的反應(yīng)在氨基酸與茚三酮的反應(yīng)在100 100 dydadyda（雙二酮茚亞（雙二酮茚亞胺）最大吸收波長(zhǎng)胺）最大吸收波長(zhǎng)570nm570nm 測(cè)定亞氨基酸選用測(cè)定亞氨基酸選用440nm440nm。（pro）5 5 檢測(cè)器檢測(cè)器光柵式分光光度器光柵式分光光度器 流動(dòng)池石英流動(dòng)池石英 兩個(gè)吸收波長(zhǎng)即兩個(gè)吸

7、收波長(zhǎng)即570nm570nm和和440nm440nm熒光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器熒光劑為熒光胺和鄰苯二胺熒光劑為熒光胺和鄰苯二胺 熒光檢測(cè)器不能測(cè)定亞氨基酸。熒光檢測(cè)器不能測(cè)定亞氨基酸。三、三、 試樣處理方法試樣處理方法1.1.上機(jī)分析試液的要求上機(jī)分析試液的要求 (1)(1)澄清透明澄清透明 (2)(2)無(wú)色或略帶淺黃色無(wú)色或略帶淺黃色 (3)(3)含鹽量低，含氨量低含鹽量低，含氨量低 (4)(4)無(wú)蛋白質(zhì)或肽類(lèi)物質(zhì)無(wú)蛋白質(zhì)或肽類(lèi)物質(zhì) (5)ph(5)ph以以2 22 2為宜為宜 (6)(6)氨基酸合適濃度以氮計(jì)為氨基酸合適濃度以氮計(jì)為1 110nm10nm50ul50ul左右。左右。2.試樣的前處

8、理試樣的前處理1 1）酸處理法）酸處理法 一般用一般用 6mol.l6mol.l-1-1鹽酸溶液，于鹽酸溶液，于110110水解水解20-90h ,20-90h ,稀釋過(guò)濾后真空蒸發(fā)至干稀釋過(guò)濾后真空蒸發(fā)至干, , 加加 0.02mol.l0.02mol.l-1-1鹽酸溶解。鹽酸溶解。 可得到除可得到除色氨酸色氨酸、胱氨酸胱氨酸外的所有氨基酸。外的所有氨基酸。過(guò)甲酸氧化法過(guò)甲酸氧化法 在鹽酸水解前，先用過(guò)甲酸氧化，在鹽酸水解前，先用過(guò)甲酸氧化，再進(jìn)行鹽酸水解，再進(jìn)行鹽酸水解， 胱氨酸與半胱氨酸得到測(cè)定，色氨酸胱氨酸與半胱氨酸得到測(cè)定，色氨酸和蛋氨酸回收提高。和蛋氨酸回收提高。 2 2）堿水解法

9、）堿水解法 一般用氫氧化銨或氫氧化鈉，置入水解管中一般用氫氧化銨或氫氧化鈉，置入水解管中于于110110水解水解20h20h，水解液用鹽酸中和，水解液用鹽酸中和，過(guò)濾后上機(jī)分析，。過(guò)濾后上機(jī)分析，。 保護(hù)色氨酸，但其他氨基酸被破壞。保護(hù)色氨酸，但其他氨基酸被破壞。3）酶水解法）酶水解法 蛋白酶具有專(zhuān)一性蛋白酶具有專(zhuān)一性 酶本身是蛋白質(zhì)，除去困難酶本身是蛋白質(zhì)，除去困難 現(xiàn)只能運(yùn)用于特定氨基酸的分析?，F(xiàn)只能運(yùn)用于特定氨基酸的分析。 測(cè)定正丁醇的校正因子，以乙醇做內(nèi)標(biāo)，測(cè)定正丁醇的校正因子，以乙醇做內(nèi)標(biāo)，稱(chēng)取稱(chēng)取0.1268g0.1268g正丁醇和正丁醇和0.1783g0.1783g乙醇，溶乙醇，溶解混勻后，取解混勻后，取1ul1ul注入色譜柱中進(jìn)行分析，注入色譜柱中進(jìn)行分析，測(cè)得峰面積正丁醇為測(cè)得峰面積正丁醇為108.4mm108.4mm2 2，乙醇為，乙醇為185.4mm185.4mm2 2。計(jì)算正丁醇相對(duì)于乙醇的校。計(jì)算正丁醇相對(duì)于乙醇的校正因子。正因子。 某試樣只要求分析其中二甲苯的三個(gè)某試樣只要求分析其中二甲苯的三個(gè)異構(gòu)體，若選用甲苯做內(nèi)標(biāo)，稱(chēng)取試異構(gòu)體，若選用甲苯做內(nèi)標(biāo)，稱(chēng)取試樣