單克隆抗體制備標(biāo)準(zhǔn)化操作方案

1、單克隆抗體制備標(biāo)準(zhǔn)化操作方案抗體, 單克隆, 方案, 制備, 標(biāo)準(zhǔn)化第一章: 小鼠免疫第二章: 滋養(yǎng)細(xì)胞的制備第三章: 細(xì)胞融合第四章: 篩選分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞 (ELISA法)第五章: 雜交瘤細(xì)胞的亞克隆培養(yǎng)第六章: 雜交瘤細(xì)胞系的凍存與復(fù)蘇第七章：腹水制備第八章：附件第一章 小鼠免疫小鼠免疫是單抗制備的關(guān)鍵一環(huán),質(zhì)控小鼠免疫是制備優(yōu)質(zhì)單抗的唯一保證。好的免疫果:血清效價(jià)達(dá)一萬以上，脾臟粘連且大小是正常鼠的兩倍以上。小鼠的選擇：選擇與所用骨髓瘤細(xì)胞同源的Balb/c健康雌性小鼠，鼠齡在812周。為避免小鼠反應(yīng)不佳或免疫過程中死亡，可同時(shí)免疫34只小鼠。免疫原：免疫原的純度一般并不重要。但有

2、時(shí)免疫原純度也會(huì)造成很大影響，若雜質(zhì)存在使免疫反應(yīng)減弱，或篩選方法不能區(qū)分對(duì)特意性成分反應(yīng)的抗體及對(duì)雜質(zhì)反應(yīng)的抗體，以及有些抗原的免疫原性十分強(qiáng)，即便痕跡量的存在，也會(huì)影響對(duì)所識(shí)別抗原的免疫反應(yīng)。上述諸情況下使用純化抗原會(huì)更有利。 常用的免疫方案：（一） 可溶性抗原初次免疫： 50100g蛋白抗原加等體積福氏完全佐劑乳化到滴水不化即可做小鼠背部皮下多點(diǎn)注射，注射體積500l/只小鼠，四周后進(jìn)行第二次免疫     第二次免疫：50100g（2550ug，為初免劑量一半）蛋白抗原（與初免等量），加等體積福氏不完全佐劑乳化到滴水不化即可做小鼠背部皮下多點(diǎn)注射，

3、注射體積500l/只鼠兩周后采小鼠尾靜脈血離心取血清測(cè)效價(jià) （用ELISA方法檢測(cè)）效價(jià)達(dá)一萬以上的小鼠融合前三天取抗原25g（50100ug，與初免劑量相同）加強(qiáng)免疫，尾靜脈注射，注射體積200l/只300ul/只，效價(jià)在一萬以下的小鼠繼續(xù)第三次免疫第三次免疫：50g蛋白抗原加等體積福氏不完全佐劑乳化到滴水不化即可做小鼠腹腔注射，注射體積500l/只，小鼠融合前三天取抗原25g加強(qiáng)免疫，注射體積200l/只。（二） 顆粒性（細(xì)胞）抗原可用5×1062×107細(xì)胞與完全佐劑混合，作皮下或腹腔注射，23周后重復(fù)一次，但佐劑改為不完全佐劑，再待23周后用同樣劑量細(xì)胞或半量細(xì)胞靜

4、脈注射，34天后取脾融合。為挑選免疫反應(yīng)較好的動(dòng)物進(jìn)行融合，第二次免疫后10天左右應(yīng)從尾部取血，檢查抗體滴度。另外，還有脾內(nèi)注射法和體外培養(yǎng)法。第二章 飼養(yǎng)細(xì)胞的制備體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，一般單個(gè)或極少數(shù)分散狀態(tài)細(xì)胞是不能存活的（或生長不良）必需加入一定量的其他細(xì)胞達(dá)一定的密度才能生長得好，加入的細(xì)胞稱為飼養(yǎng)細(xì)胞。用細(xì)胞融合術(shù)建立雜交瘤細(xì)胞時(shí)，飼養(yǎng)細(xì)胞的加入是不可缺少的，常用的有正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞、胸腺細(xì)胞，也有人用經(jīng)過照射或絲裂霉素處理的纖維母細(xì)胞，如3T3或Putler等。一、 實(shí)驗(yàn)材料1.1 RPMI-1640完全培養(yǎng)液：具體配法見實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞融合2.3。1.2 HAT培養(yǎng)液或HT培

5、養(yǎng)液：具體配法見實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞融合2.4和2.5。1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： Balb/c或昆明種健康小鼠（雌雄均可）1只，610周齡，體重18 22克，本院動(dòng)物中心繁殖和飼養(yǎng)。每只小鼠可取得35×106 的滋養(yǎng)細(xì)胞，可供鋪6塊板用，應(yīng)在融合或克隆前12天制備。1.4 離心機(jī)一臺(tái)，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，無菌塑料離心管，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。小鼠解剖臺(tái)板或平皿；無菌眼科剪刀、鑷子各數(shù)把；大鑷子一個(gè)；止血鉗兩個(gè)。一次性5ml注射器2套。二、實(shí)驗(yàn)方法2.1 將Balb/c小鼠拉頸脫臼處死，浸泡于75%酒精5分鐘，隨即放入超凈工作臺(tái)內(nèi)，腹部朝上放于平皿內(nèi)或固定于解剖板上。 2.2  用眼科鑷子

6、夾起小鼠腹部皮膚，用剪刀剪一小口，注意切勿剪破腹膜， 以免腹腔液外流。然后用剪刀向上下兩側(cè)做鈍性分離，充分暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。2.3  用注射器吸取5ml RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，注入小鼠腹腔，注射器停留不動(dòng)，晃動(dòng)小鼠或反復(fù)抽吸幾次。用原注射器抽回腹腔內(nèi)液體，注入離心管。如此反復(fù)操作34次。2.4  1000rpm離心10min，棄上清。2.5  用2050ml完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，100l/孔滴加到培養(yǎng)板，置培養(yǎng)箱備用。2.6 觀察飼養(yǎng)細(xì)胞的生長狀態(tài)，一般生長良好的飼養(yǎng)細(xì)胞和巨嗜細(xì)胞呈梭形或多角形、細(xì)胞透亮、折光性

7、強(qiáng)。第三章 細(xì)胞融合細(xì)胞融合是人工定向制造新細(xì)胞品系的重要手段，也是制造單克隆細(xì)胞系的關(guān)鍵技術(shù)。在保證有良好的親本細(xì)胞、穩(wěn)定和良好的培養(yǎng)體系的條件下，細(xì)胞融合的成敗和融合率則取決于融合劑和操作技巧。細(xì)胞融合的助融劑和助融手段主要有三種；生物學(xué)方法：用仙臺(tái)病毒或雞新城疫病毒作助融劑。物理學(xué)方法：用電融合儀發(fā)出的脈沖電流使相鄰的兩細(xì)胞穿孔而融合?；瘜W(xué)方法：用聚乙二醇或血卵磷脂作助融劑。PEG作助融劑是比較方便簡單的操作方法，具體方法如下：一、實(shí)驗(yàn)材料1.1 眼科鑷子、剪刀數(shù)把、固定板。1.2 37溫水。1.3 酒精燈、離心管架、離心管、離心機(jī)、5-10ml吸管、1ml吸管、滴管、計(jì)數(shù)池、平皿數(shù)個(gè)。

8、二、實(shí)驗(yàn)試劑2.1 融合劑：50%PEG W=3000PEG3000   1gRPMI1640         1ml8-10磅滅菌2.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)液（RPMI1640）RPMI1640 一包 (10.4g)L-G （L-谷氨酰胺） 0.3gHEPES  3.0g碳酸氫鈉 3.0g慶大霉素 一支三蒸水加至 1000ml2.3 1640完全培養(yǎng)液基礎(chǔ)培養(yǎng)液   180ml胎牛血清   20ml2.4  HT培養(yǎng)液（終濃度H為1×

9、10-4M，T為1.6×10-5M）基礎(chǔ)培養(yǎng)液 197.5mlHT濃縮液（100×） 2.5ml胎牛血清   50ml一次融合約配250毫升2.5 HAT培養(yǎng)液（終濃度A為4×10-7M）基礎(chǔ)培養(yǎng)液 197.5mlHAT濃縮液（100×）  2.5ml胎牛血清  50ml2.6  細(xì)胞凍存液1640完全培養(yǎng)液    70mlDMSO   10ml胎牛血清   20ml2.7 3%醋酸溶液30%乙酸 

10、60;10mldH2O            90ml三、實(shí)驗(yàn)步驟3.1 脾細(xì)胞制備：取加強(qiáng)免疫小鼠一只，眼眶采血后脫臼處死，在75%酒精中消毒后取脾臟，去除結(jié)締組織，制備脾細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，加RPMI1640至30ml，15002000rpm離心5分鐘，棄上清，加RPMI1640至30ml，白細(xì)胞稀釋液稀釋20倍，計(jì)數(shù)，取1×108個(gè)細(xì)胞待用。3.2 骨髓瘤細(xì)胞制備：取3瓶生長狀態(tài)良好的（活細(xì)胞數(shù)>95%）骨髓瘤細(xì)胞，將之完全吹下，轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，加RPMI1640至30m

11、l，15002000rpm離心5分鐘，棄上清，加RPMI1640至30ml，RPMI1640稀釋10倍，計(jì)數(shù)，取2×107個(gè)細(xì)胞待用。3.3 細(xì)胞混合：脾細(xì)胞:骨髓瘤=5：1，混合，15002000rpm離心5分鐘。注意：由于細(xì)胞融合是個(gè)隨機(jī)過程，母細(xì)胞比例不一，會(huì)影響融合產(chǎn)物；或是兩種母細(xì)胞融合而成的雜交細(xì)胞，或是一種細(xì)胞自身融合產(chǎn)物。多數(shù)實(shí)驗(yàn)者采用骨髓瘤細(xì)胞：脾細(xì)胞1：5，也有人采取其他比例，如骨髓瘤細(xì)胞：脾細(xì)胞1：5，甚至是1：1。減少脾細(xì)胞用量目的是降低脾細(xì)胞自身融合的機(jī)率。3.4 細(xì)胞融合：將離心上清倒干，把沉淀細(xì)胞塊彈成糊狀，置37水浴，在1分鐘內(nèi)加入1ml融合劑，并攪拌

12、細(xì)胞，37水浴放置 45秒，在1分鐘內(nèi)加入1ml 1640并攪拌細(xì)胞 終止融合劑的融合作用，500rpm離心7分鐘，棄上清。2分鐘內(nèi)加入5ml 1640并攪拌細(xì)胞 2分鐘內(nèi)加入10ml 1640并攪拌細(xì)胞2分鐘內(nèi)加入10ml 1640并攪拌細(xì)胞3.5 細(xì)胞培養(yǎng)：輕輕將細(xì)胞彈勻，緩緩加入HAT培養(yǎng)液至所需體積，將細(xì)胞重懸，輕輕地將之混勻，加到預(yù)先準(zhǔn)備好的飼養(yǎng)細(xì)胞板中。 10ml吸管滴加1滴（配8ml/板），排槍滴加80100微升（配10ml/板），37，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)、觀察。3.6 細(xì)胞培養(yǎng)、換液：細(xì)胞融合后第一天開始，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行仔細(xì)觀察，記錄好細(xì)胞的生長狀態(tài)、每孔雜交細(xì)胞瘤個(gè)數(shù)、塊數(shù)、培養(yǎng)液

13、有無污染、飼養(yǎng)細(xì)胞的狀況。培養(yǎng)35天HAT培養(yǎng)液換液一次，10天換HT培養(yǎng)液培養(yǎng)至20天，換1640完全培養(yǎng)液。四HAT選擇培養(yǎng)液的作用在細(xì)胞融合時(shí)，可以出現(xiàn)：脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合，脾細(xì)胞之間的融合，骨髓瘤之間融合，此外還有大量的未融合細(xì)胞。如何除去大量未融合及自身融合的細(xì)胞呢？下面簡介HAT液作用。谷氨酰胺（L-Glutamine），尿核苷單磷酸都是正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞用來合成DNA的重要成分（主要途徑），但是這條途徑可以被氨基喋呤（Aminopterin）切斷。另外還有一條應(yīng)急途徑即細(xì)胞內(nèi)的HGPRT（次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶）利用（H）和TK（胸腺嘧啶激酶）利用（T）合成DNA

14、。骨髓瘤細(xì)胞株是經(jīng)過8-偶氮鳥嘌呤篩選出來的，不含HGPRT，因此不能借用應(yīng)急途徑合成DNA，只能靠主要途徑合成DNA。骨髓瘤細(xì)胞在HAT液中，因缺少HGPRT和TK，不能利用H·T合成DNA，主要途徑又被氨基喋呤阻斷，因此細(xì)胞死亡。免疫鼠脾細(xì)胞，雖含有HGPRT但不適應(yīng)體外培養(yǎng)，一般十天左右自然滅亡。雜交細(xì)胞，在融合時(shí)脾細(xì)胞的HGPRT被帶入，通過應(yīng)急途徑利用H·T合成DNA，并繼承骨髓瘤細(xì)胞體外繁殖的特性，所以能存活。一般融合后常用含20%胎牛血清培養(yǎng)液，通過篩選，亞克隆選出有關(guān)雜交細(xì)胞后，則可換成含10%胎牛血清培養(yǎng)液。對(duì)已確定的雜交瘤株，則可換成含5%胎牛血清的培養(yǎng)

15、液培養(yǎng)。               第四章 篩選分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞融合后當(dāng)雜交細(xì)胞集落生長到一定大小，培養(yǎng)液開始變黃，便可開始篩選抗體活性。許多方法都可以用來篩選，但應(yīng)注意到篩選單克隆抗體時(shí)的一些特點(diǎn)；首先，培養(yǎng)上清中的抗體含量低于高效抗血清的抗體含量。其次，與普通抗血清不同，單克隆抗體不能多價(jià)地識(shí)別抗原。所以用來篩選單克隆抗體的方法應(yīng)照顧到單克隆抗體的特點(diǎn)，而且要準(zhǔn)確、迅速和方便。此外應(yīng)根據(jù)所需要抗體的特點(diǎn)，選擇不同類型的方法。 一般常用的有：免疫熒光、放射免疫（RIA）、組織化學(xué)法和酶聯(lián)

16、免疫分析（ELISA）法等。最經(jīng)常用方法是ELISA法。在收集上清時(shí)，應(yīng)在上次換液后3-4天進(jìn)行，以便抗體積累。上清可不經(jīng)稀釋或1：51：10稀釋后再測(cè)抗體活性，用稀釋抗體進(jìn)行篩選時(shí)可以篩掉弱陽性的抗體，也可以去掉因高本底所造成的假陽性。融合后第一次篩選出的陽性克隆可能因陰性克隆或其他陽性克隆的過度生長而丟失，故應(yīng)盡早亞克隆。第一次篩選后也可能沒篩選到陽性抗體，這可能由于分泌陽性抗體的細(xì)胞為數(shù)尚少，應(yīng)重復(fù)測(cè)定活性2-3次?，F(xiàn)將ELISA法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞抗體的方法介紹如下：（一） 實(shí)驗(yàn)試劑    1磷酸鹽緩沖液（PBS）（10×濃縮）氯化鈉（NaCl）50g氯化鉀（

17、KCl）1.25g磷酸二氫鉀（KH2PO4）1.25g磷酸氫二鈉（Na 2 HPO4·12H2O）18.1g蒸餾水加至1000ml用1M HCL調(diào)pH至7.22. 封閉液正常牛血清10ml1×PBS（不含吐溫）90ml3. 洗滌緩沖液吐溫-20（Tween 20）0.2ml1×PBS1000ml4底物顯色A液醋酸鈉（CH3 COONa）13.6g檸檬酸（C6H8O7·H2O）1.6g雙氧水（H2O2 30%） 0.3ml蒸餾水加至  500ml5底物顯色B液 乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）0.2g檸檬酸（C6H8O7·

18、H2O）0.95g甘油 （C3H8O3）50ml四甲基聯(lián)苯胺（TMB） 0.2g蒸餾水加至    500ml6終止液（2M H2SO4 ）取濃H2SO4  27.62ml，緩緩加入到473ml的蒸餾水中，混勻即可。注意在加入硫酸的過程中，不要加得太快，以免過熱。7抗原包被液（0.1M碳酸鹽緩沖液）pH 9.6碳酸鈉（Na2CO3）1.59g碳酸氫鈉（NaHCO3）2.93g疊氮鈉（NaN3） 0.2g蒸餾水加至 1000ml8辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（已商品化）。 （二）實(shí)驗(yàn)步驟1抗原包被：純抗原濃度一般為12g/ml，用包被液稀釋后取100l

19、加入聚苯乙烯酶聯(lián)檢測(cè)板各孔中，4過夜后，洗液洗滌3次。建議4包被過夜2封閉： 每孔加200l或加滿封閉液，4過夜或37兩小時(shí)后，洗滌3次，拍干。置4冰箱保存?zhèn)溆谩?ELISA檢測(cè)（1）加待測(cè)樣品：檢測(cè)融合板時(shí)，無菌條件下取細(xì)胞上清，50100l/孔加樣到包被好的酶標(biāo)板中，同時(shí)，每板分別選取無細(xì)胞生長的兩孔為陰性對(duì)照，另選取無細(xì)胞生長的兩孔加入陽性血清作為陽性對(duì)照；檢測(cè)血清或腹水效價(jià)時(shí)，對(duì)血清或腹水做倍比稀釋，100l/孔，以正常小鼠血清為陰性對(duì)照，37孵育30min，洗滌3次，拍干。（2）加二抗：根據(jù)酶標(biāo)二抗的效價(jià)選擇稀釋倍數(shù)，100l/孔，37孵育30min，洗滌3次，拍干。（3）顯色：加入

20、A、B液各80l/孔，37顯色15min。（4）終止：加入終止液80l/孔。（5）讀數(shù)： 以450nm單波長測(cè)定各孔OD值，以與陰性對(duì)照孔OD值的比值（P/N）大于2.1為限，作為判斷為陽性或確定效價(jià)的臨界點(diǎn)。 第五章 雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)經(jīng)檢測(cè)的雜交細(xì)胞雖然分泌抗體，但它可能是一個(gè)雜交細(xì)胞，也可能是多個(gè)雜交細(xì)胞的后代所分泌的抗體，因此必須進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，以獲得得一個(gè)既有克隆原性又分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株。融合早期的雜交細(xì)胞很不穩(wěn)定，易喪失分泌抗體能力，因此盡早克隆化培養(yǎng)（細(xì)胞生長約占孔底面積的1/4-1/3）。通常經(jīng)過2-3次克隆化培養(yǎng)雜交細(xì)胞即可穩(wěn)定下來。為防止雜交細(xì)胞變異或污染等情況，在

21、克隆化同時(shí)要凍結(jié)保存以防失種?？寺』囵B(yǎng)方法常用如下三種：（一） 雜交細(xì)胞直接接種法將陽性雜交細(xì)胞團(tuán)從培養(yǎng)板孔內(nèi)吸出，放入裝有0.51.0ml無血清培養(yǎng)液的小皿內(nèi)，分散細(xì)胞后，用毛細(xì)吸管吸取單個(gè)細(xì)胞，種入有飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)板孔內(nèi)，37CO2溫箱培養(yǎng)。（操作均在潔凈臺(tái)內(nèi)倒置顯微鏡下進(jìn)行）。（二） 半固體瓊脂培養(yǎng)法將陽性孔雜交細(xì)胞分散計(jì)數(shù)制成細(xì)胞懸液與瓊脂及完全培養(yǎng)液適當(dāng)量混合接種在培養(yǎng)皿里，37CO2孵箱培養(yǎng)，約57天長成細(xì)胞集落，用槍頭吸取分散成懸液，再接種96孔板內(nèi)培養(yǎng)。（三） 有限稀釋法此法簡便適用廣為采納。（1）準(zhǔn)備一塊有飼養(yǎng)細(xì)胞生長的96孔板（2.5×104細(xì)胞/0.1ml/孔

22、）。（2）將陽性孔雜交細(xì)胞計(jì)數(shù)制成細(xì)胞懸液。（3）把96孔板分為4組，每組24孔，將細(xì)胞懸液按倍比法稀釋成4組溶液，即每組每毫升含100、50、25、12.5個(gè)細(xì)胞，以0.1ml/孔加板培養(yǎng)。（4）約10天左右選擇單克隆孔，檢測(cè)抗體，如陽性者，再克隆，直至100%孔分泌抗體。此時(shí)選擇抗體陽性強(qiáng)、細(xì)胞生長好的克隆，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，建系，保存。 第六章 雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇（一）細(xì)胞的凍存-液體氮保存1凍存液配方：二甲基亞砜凍存液（Dimethyl sulfoxide）10.0ml新生牛血清 30.0ml1640培養(yǎng)液60.0ml丙三醇凍存液（Glycerol） 10.0ml新生牛血清 10.0ml1640培養(yǎng)液80.0ml2凍存程序：（1）冷凍管高壓滅菌備用。（2）凍存細(xì)胞必須生長良好，活細(xì)胞大于90%經(jīng)2000rpm離心5min，吸去上清。（3）