復(fù)雜樣品的色譜分離分析

1、一 復(fù)雜樣品的分離分析引言：隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，尤其是分子生物學(xué)和計(jì)算機(jī)的推動(dòng)，當(dāng)前分析科學(xué)取得長(zhǎng)足的進(jìn)步，各種新的分析儀器和方法無(wú)論在適用性和靈敏度方面都有很大的發(fā)展過(guò)去需要幾年才能測(cè)定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，現(xiàn)在幾個(gè)小時(shí)就可以迅速測(cè)定，人類基因圖譜的完全測(cè)定曙光已在眼前。采用高效毛細(xì)管色譜(包括毛細(xì)管電泳)很快分離上百個(gè)成分已不是困難的事，色譜和各種結(jié)構(gòu)測(cè)定手段的在線聯(lián)用，使得無(wú)論對(duì)已知化合物的在線監(jiān)測(cè)，還是對(duì)未知混合物的分析能力都大為增強(qiáng)。目前分析化學(xué)正在生命科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、材料科學(xué)、藥物學(xué)等前沿領(lǐng)域發(fā)揮極大的推動(dòng)作用但是隨著這些學(xué)科的不斷發(fā)展，分析樣品正變得越來(lái)越復(fù)雜。分析任務(wù)也變得越來(lái)越艱

2、巨進(jìn)入21世紀(jì)，人們將逐漸告別單一組成的分析，越來(lái)越多地面臨復(fù)雜樣品的分離分析，組成一結(jié)構(gòu)一功能將是人們關(guān)心的焦點(diǎn)，復(fù)雜樣品將是擺在人們面前的分析難題一復(fù)雜樣品分析的基本思路復(fù)雜樣品是指組分種類多、含量差別大、已知信息少幾乎為一黑箱的復(fù)雜混合物。這樣的樣品在生物、環(huán)境、材料中占大多數(shù)例如中藥提取物或環(huán)境污染物來(lái)源于自然界，常常含有從無(wú)機(jī)到有機(jī)、從離子性、強(qiáng)極性到非極性、從小分子到大分子、從位置異構(gòu)體到對(duì)映體、從常量到痕量的上百種成分，而且這些成分大都是未知的即使是曾被發(fā)現(xiàn)的成分，也很難獲得純品或?qū)φ掌?，與大量未知物混于一體，無(wú)異于未知化食物。復(fù)雜樣品的分析，首先需要弄清組成這一樣品體系的各種組

3、成及其比例關(guān)系，了解組成這一體系的基本組分分布，在此基礎(chǔ)上，還需對(duì)每一組成進(jìn)行詳細(xì)了解，如結(jié)構(gòu)確定，為最終闡明組成一結(jié)構(gòu)一功能提供依據(jù)(或根據(jù)組成一功能關(guān)系先確定有效組成，再確定這些有效組成的結(jié)構(gòu))因此，對(duì)復(fù)雜樣品的分離分析，可按三個(gè)層次進(jìn)行研究：(1)利用高效色譜進(jìn)行復(fù)雜混合物的系統(tǒng)分離分析，獲得基本組成色譜峰及其比例關(guān)系：(2)混合物組成成分的結(jié)構(gòu)鑒定，這包括離線各種光譜、質(zhì)譜的綜合鑒定及色譜和各種技術(shù)的在線聯(lián)用，尤其是聯(lián)用技術(shù)不僅可以進(jìn)行快速簽定，而且由于減少了處理步驟，避免了處理過(guò)程造成的組分損失，因此具有更高的定量可靠性，對(duì)含量少的組分也可以進(jìn)行定性(這些含量少的組分是比較難于得到純

4、品的)；(3)盡管高效色譜和各種光譜、質(zhì)譜的聯(lián)用技術(shù)可以極大地促進(jìn)復(fù)雜混合物的分析，但應(yīng)該看到聯(lián)用技術(shù)般要求色譜能分離獲得純色譜峰，才能較好地獲得其光譜、質(zhì)譜，進(jìn)行較好的分析由于樣品組分復(fù)雜，在實(shí)際分離中即使采用多柱系統(tǒng)在最優(yōu)化條件下，仍會(huì)有大量的不同程度重疊峰，因此，利用先進(jìn)的算法和計(jì)算機(jī)，結(jié)合色譜和各種光譜、質(zhì)譜規(guī)律，進(jìn)行多維分析信號(hào)與信息的綜合處理，解決重疊峰的解析和定性、定量，最終完成復(fù)雜樣品的分析任務(wù)二復(fù)雜樣品組成的多模式多柱色譜及聯(lián)用技術(shù)的綜合分離分析對(duì)于復(fù)雜樣品的分析，盡管現(xiàn)代高效色譜拄具有很高的柱效，借助于計(jì)算機(jī)模擬、優(yōu)化可獲得極佳的分離效果，但由于樣品幾乎包含各類化合物離子性

5、、強(qiáng)極性、中等極性、弱極性、對(duì)映體、揮發(fā)油類、大分子、金屬離子和微量元素等，解決此類復(fù)雜體系的分離分析，仍需要發(fā)展智能多模式多柱系統(tǒng)(1MMlCC)以及色譜與其它技術(shù)的聯(lián)用這是因?yàn)閷?duì)于不同的色譜模式各有其內(nèi)在的優(yōu)點(diǎn)，它們各自都有解決特定分離問(wèn)題的優(yōu)勢(shì)因此利用不同色譜模式、不同柱子的特性和優(yōu)勢(shì)，取長(zhǎng)補(bǔ)短，可以利用不同柱子對(duì)樣品組分的選擇性、互補(bǔ)性來(lái)達(dá)到單模式、單柱子色譜系統(tǒng)所不能解決的分離問(wèn)題 智能多模式多柱系統(tǒng)及其聯(lián)用技術(shù)包括高效液相色譜(服LC)、氣相色譜(GC)、毛細(xì)管電泳(CE)和各種聯(lián)用技術(shù)等眾多于段，它利用計(jì)算機(jī)技術(shù)并結(jié)合了色譜專家的知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)，是智能的、統(tǒng)一的分析方法1 對(duì)一些極性

6、有機(jī)溶劑提取物可以綜合考慮不同液相色譜方法進(jìn)行分離分析 通常對(duì)于未知復(fù)雜混合物的分析，首先采用合適的溶劑進(jìn)行溶解或提取其中成分進(jìn)行分離分析研究根據(jù)樣品不同性質(zhì)可以來(lái)用不同極性的溶劑進(jìn)行溶解和多步提取，獲得其一種或多種樣品成分 對(duì)于所獲得的組分，應(yīng)盡量進(jìn)行簡(jiǎn)單的處理，減少成分損失利用簡(jiǎn)單濃縮，然后過(guò)濾宣接利用色譜進(jìn)行分離分析，充分發(fā)展色譜方法，進(jìn)行復(fù)雜混合物的分離分析不失為一種高效的方法對(duì)于未知的復(fù)雜樣品提取物，可以根據(jù)提取溶劑進(jìn)行方法的初步發(fā)展對(duì)于極性溶劑提取物一般可以利用目前應(yīng)用比較成熟的反相液相色譜進(jìn)行分離柱子選擇以Cls柱為主，根據(jù)分離情況可以進(jìn)行不同C18柱及C8柱及苯基拄組成多柱系統(tǒng)

7、進(jìn)行互補(bǔ)分離一般Q s填料裝填好，技效高，適用性廣，與其它填料相比，Qs填料對(duì)各類樣品均有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，因此可以以q8柱作為第一柱從色譜填料的發(fā)展來(lái)看，采用少含金屬離子高純硅膠基質(zhì)作原料，鍵合相均勻，封尾好，殘余硅經(jīng)基少，碳含量高(16)是目前校子發(fā)展的主要方向另外，細(xì)管徑、細(xì)粒徑填料(如3仰)可以獲得更高的拄效，具有更強(qiáng)的分離能力，這些都十分有利于復(fù)雜樣品的分離分析在柱子確定之后，流動(dòng)相的選擇是影響分離的最為重要的因素，流動(dòng)相選擇的目的是使所有組分流得出、分得開(kāi)、分析時(shí)間最短甲醇冰體系以其選擇性好價(jià)格便宜，應(yīng)用最為廣泛，可以作為未知化合物分離時(shí)選擇流動(dòng)相的第一選擇除此之外，可以選擇乙臘休、

8、四氫映喃冰進(jìn)行互補(bǔ)分離，并可采用異丙醇P醇分離部分強(qiáng)保留成分，所有這些流動(dòng)相可以組成多二元流動(dòng)相進(jìn)行互補(bǔ)分離對(duì)于用純水溶解或提取的樣品常常含有強(qiáng)極性、離子性化合物，對(duì)于這些化合物的分離分析*在常規(guī)反相色譜中會(huì)幾乎不保留，因而沒(méi)有分離效果對(duì)于這些成分的分析應(yīng)考慮調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值、利用反相離子對(duì)色譜進(jìn)行分離分板比較常用的方法是控制pH值在酸性范圍(pH值25)，并利用十二烷基磺酸鈉、庚烷磺酸鈉等進(jìn)行方法初步發(fā)展，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整或多種途徑互補(bǔ)分離2對(duì)于有一定揮發(fā)性的化臺(tái)物應(yīng)優(yōu)先采用氣相色譜進(jìn)行分離與液相色譜相比較，氣相色譜具有快速、準(zhǔn)確、分離效率高、檢測(cè)靈敏度高，一次測(cè)定能得到多種組分的

9、定量結(jié)果等眾多優(yōu)點(diǎn)，因此對(duì)子有一定揮發(fā)性的樣品應(yīng)盡量利用氣相色譜進(jìn)行分離分析對(duì)于非極性溶劑(如石油醚)提取物，主要以非極性化臺(tái)物為主，可以利用氣相色譜進(jìn)行分離分板并且可以首先選擇一根非極性的柱子(如DB1)進(jìn)行分離然后選用極性稍有差別的弱極性柱(如皿5)作為第二根柱進(jìn)行雙柱分離，甚至再選一根極性住進(jìn)行非常復(fù)雜混合物的多柱互補(bǔ)分離在每一根柱子上都需要選擇最佳的分離條件充分發(fā)揮其柱效，并實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)分離3毛細(xì)管電泳應(yīng)作為液相色譜補(bǔ)充和發(fā)展毛細(xì)管電泳，又叫高效毛細(xì)管電泳(比)(五)，是近年來(lái)發(fā)展最快的分板方法之一毛紉管電泳是經(jīng)典電泳技術(shù)和現(xiàn)代微住分離相結(jié)合的產(chǎn)物，其優(yōu)點(diǎn)可概括為三高二少，即高靈敏度、高分

10、辨率、高速度、進(jìn)樣少、溶劑用量少與液相色譜類似毛細(xì)管電泳也有多種操作模式，即毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZL)、膠柬電動(dòng)毛細(xì)管色譜(M蓖CC)、毛紉管凝膠電泳(cGE)、毛細(xì)管等電聚焦(C12F)、毛細(xì)管等速電泳(CIEF)及毛細(xì)管電色譜(LKL)目前，毛細(xì)管電泳在生命科學(xué)中已廣為利用，但隨著膠束電動(dòng)毛細(xì)瞥色譜、毛細(xì)瞥電色譜等技術(shù)的迅速發(fā)展，毛細(xì)管電泳在有機(jī)物的分折應(yīng)用也正逐漸展開(kāi)將毛細(xì)管電泳與液相色譜結(jié)合的新型色譜技術(shù)毛細(xì)管電色譜具有液相色譜的分離機(jī)理，但由于其采用電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相代替壓力驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相，在很大程度上消除導(dǎo)致柱效降低的擴(kuò)散因素，因此具有更高的柱效，目前這一研究正以極快的速度迅速發(fā)展毛細(xì)管電泳

11、將以其超強(qiáng)分離能力及樣品和溶劑消耗低等優(yōu)點(diǎn)，在復(fù)雜樣品的分折中扮演越來(lái)越重要的角色4色譜和其它結(jié)構(gòu)測(cè)定技術(shù)的聯(lián)用是解決復(fù)雜樣品分板的強(qiáng)有力的手段色譜的優(yōu)勢(shì)在于分離，在常規(guī)的紫外檢測(cè)器上對(duì)于無(wú)紫外吸收化合物的檢測(cè)和大量未知化合物的定性分析還須依賴于其它分板手段色譜和質(zhì)諳的聯(lián)用是目前最受重視的手段，除傳統(tǒng)的氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(G()MS)外進(jìn)入90年代液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LCMS)的發(fā)展最為引人注目這是因?yàn)楸萂S不完全同于GGMS*其M5應(yīng)是軟的多級(jí)質(zhì)譜(MSI) 而90年代發(fā)展的大氣壓下的液相色譜和質(zhì)譜的聯(lián)用接口電噴霧接口(踢1)和大氣壓下化學(xué)電離接口(APCI)正是兩種軟電離的接口，并且在很大程度

12、上解決了使用LCMS時(shí)對(duì)液相色譜流動(dòng)相的限制(如對(duì)純水和流速的限制)靈敏度也得到很大提高采用軟電離技術(shù)主要產(chǎn)生的是“擬”分：嚴(yán)離子峰，進(jìn)一步使用多級(jí)質(zhì)譜，可以很好地對(duì)未知化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究利用MsM5進(jìn)行選擇反應(yīng)臨測(cè)(sRM)，則具有很高的選擇性，因而具有很好的定量靈敏度和可靠性目前這一技術(shù)也成為發(fā)達(dá)國(guó)家藥物質(zhì)控的熱門(mén)手段 除液相色譜和四級(jí)桿質(zhì)譜的聯(lián)用之外，利用大氣壓下的接口，液相色譜、毛細(xì)管電泳和最新發(fā)展的正交飛行時(shí)間質(zhì)譜和離子陜質(zhì)譜也實(shí)現(xiàn)了成功聯(lián)用不僅如此，相比較基質(zhì)輔助飛行時(shí)間質(zhì)諾，基于電噴霧接口的液相色譜正交飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(如L(汀，隊(duì)QTof)不僅能對(duì)色譜流出組分進(jìn)行高靈敏度檢測(cè)

13、，而且能進(jìn)行準(zhǔn)確的分子量測(cè)定，從而可能宜接給出化合物的分子式液相色譜離子阱質(zhì)譜聯(lián)用(如LQ)可以容易地進(jìn)行多級(jí)質(zhì)諾測(cè)定，從而確定其分子量和相關(guān)的結(jié)構(gòu)信息因此，液相色譜和質(zhì)譜的成功聯(lián)用不僅對(duì)以解決色譜難于解決的化合物的定性問(wèn)題，而且也將為質(zhì)諾的分析提供極大的方便和靈活性，為質(zhì)諾提供更加廣闊的應(yīng)用前景，為復(fù)雜樣品的分析提供強(qiáng)有力的手段色譜和各種質(zhì)譜、核磁共振等定性手段的聯(lián)用是當(dāng)前儀器分析的重要發(fā)展，除色質(zhì)聯(lián)用外，氣相色譜和紅外光譜(GC-FTIR)、液相色譜和核磁共振也實(shí)現(xiàn)了聯(lián)用(LC-NMR)液扣色譜核磁共振質(zhì)諾聯(lián)用儀(比NMRMS)也已應(yīng)用于研究中復(fù)雜樣品多模式色譜及其聯(lián)用技術(shù)綜合分析的流程如

14、下： 圖1 復(fù)雜樣品多模式多綜合分析流程圖三復(fù)雜樣品分析的理論基礎(chǔ)對(duì)于復(fù)雜的未知樣品，除了充分利用先進(jìn)的儀器，采用多模式色譜及其聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行綜合分析外，還與發(fā)展與之相關(guān)的色譜分離、定性及重疊諾峰的解析方法等，進(jìn)行充分的理論基礎(chǔ)研究1色譜方法發(fā)展及優(yōu)化色譜方法發(fā)展及優(yōu)化指的是對(duì)于復(fù)雜未知樣品先初步確定其基本分離條件(如模式、柱子、流動(dòng)相等)，然后對(duì)此方法進(jìn)行優(yōu)化，如流動(dòng)相的多臺(tái)階多二元的智能優(yōu)化從而使得在繪定的柱系統(tǒng)和最佳的流動(dòng)相梯度下，樣品組分獲得較好的分離，分橋時(shí)間最短，同時(shí)色譜峰高增加，檢測(cè)靈敏度也相應(yīng)地得到提高對(duì)于未知樣品的優(yōu)化策略是將未知樣品轉(zhuǎn)化為已知樣品，弄清樣品組分的保留值規(guī)律，從

15、而利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行智能優(yōu)化即通過(guò)跟蹤不同條件下色譜峰流出次序，同時(shí)獲得各組分的保留值及峰形參數(shù)，進(jìn)一步利用這些參數(shù)通過(guò)保留值方程和峰形變化規(guī)律，采用計(jì)算機(jī)進(jìn)行分離條件的選擇和模擬實(shí)驗(yàn)，獲得其最佳分離條件未知樣品轉(zhuǎn)化為已知樣品的關(guān)鍵是如何獲取組分的保留值方程早在80年代，盧佩章提出，針對(duì)不同的最難分離物質(zhì)對(duì)，應(yīng)采用多階梯度進(jìn)行優(yōu)化的思想張樣明將這一思想用于環(huán)境樣品中大氣毒物的人工干預(yù)智能優(yōu)化，取得了很好的效果呂美玲結(jié)合多二元流動(dòng)相和臺(tái)階梯度的優(yōu)點(diǎn)，提出多臺(tái)階多二元智能優(yōu)化的設(shè)計(jì)思想，并用于多環(huán)芳烴的分離，取得較好的效果 采用多臺(tái)階多二元的智能優(yōu)化方法，一方面可以擴(kuò)大流動(dòng)相的范圍(選擇性和沖洗強(qiáng)度)

16、，滿足分離要求，另一方面優(yōu)化針對(duì)性強(qiáng)，容易難確找到最優(yōu)點(diǎn)，而且實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便因此，多臺(tái)階多二元的優(yōu)化策略為復(fù)雜體系的優(yōu)化開(kāi)辟了新天地在環(huán)境污染物多氯聯(lián)苯(P帕)和中藥黃茂分析中，兩個(gè)優(yōu)化結(jié)果如圖2及3所示t（min）圖-2多氯聯(lián)苯（PCB）的分析 tR(min) 圖3 中藥黃氏的分析 柱子：Spherisorb LC-18（5m）；流動(dòng)相：從純水，甲醇/水到70異丙醇甲醇的多臺(tái)階雙二元流動(dòng)相梯度洗脫；流速：1ml/min；檢測(cè)：200-400(UV)每秒一次PDA紫外掃描，并于203nm下提取色譜圖。2多維聯(lián)合定性復(fù)雜樣品的分析結(jié)果是一個(gè)巨大的多維信息庫(kù)，其中包括色譜、質(zhì)諧和光譜方面的大量信息需要采

17、用多維數(shù)據(jù)處理的方法和理論對(duì)大量數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，進(jìn)行多維聯(lián)合定性，并且采用不斷發(fā)展的計(jì)算機(jī)技術(shù)和化學(xué)計(jì)量學(xué)手段，通過(guò)對(duì)大量信息的提取、加工，形成統(tǒng)一的數(shù)據(jù)庫(kù)盡管色譜定性相對(duì)不足，但利用氣相色譜的Kvoat指數(shù)和液相色譜的a, c指數(shù)定性再結(jié)合其它定性手段還是有一定特色的 例如盡管色譜聯(lián)用時(shí)質(zhì)諾在很大程度上解決色諾定性上的不足，但質(zhì)譜很難對(duì)異構(gòu)體則進(jìn)行定性；相反，有些異構(gòu)體很容易被色譜分離，因此，聯(lián)合定性可以很好地解決這一問(wèn)題另外，液相色譜和光電二極管陣列紫外掃描撿測(cè)器的聯(lián)用已成為一種很常用的儀器，色譜和紫外單獨(dú)定性較差，但二者的聯(lián)合定性可以提高其可靠性通過(guò)預(yù)測(cè)保留范圍后再匹配光譜或質(zhì)譜可以大大縮

18、小匹配范圍，從而增加定性的可靠性3重疊譜圖的解析及色譜置疊峰的擬合定量復(fù)雜樣品，由于其組成極其復(fù)雜，組分間的交叉重疊會(huì)十分嚴(yán)重：一方面，要進(jìn)行操作條件的優(yōu)化，使組分獲得盡可能的分離；另一方面，還應(yīng)認(rèn)識(shí)到，對(duì)于復(fù)雜樣品的分離分析，即使在優(yōu)化的條件下，色譜峰的重量還是不可避免的因此，發(fā)展計(jì)算機(jī)擬合技術(shù)進(jìn)行重疊譜峰的解析是十分必要的例如，對(duì)于中藥提取物，包含不同種類、異構(gòu)體等多種化合物，其色譜峰必然會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的交叉重疊，因此，中藥的色譜分析面臨的是大量重疊峰的定性、定量對(duì)于重疊譜的解析，一方面要充分利用化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法進(jìn)行色譜、光譜解析，發(fā)展各種譜的綜合解析方法，另一方面，還要更深入地認(rèn)識(shí)色譜峰形規(guī)律、質(zhì)譜規(guī)律等譜學(xué)規(guī)律，利用規(guī)律解決問(wèn)題目前基于色譜動(dòng)力學(xué)所進(jìn)行色譜峰形預(yù)測(cè)和重疊峰的解析已可以很好地?cái)M音色譜峰，但這一規(guī)律還需進(jìn)步結(jié)合質(zhì)譜等譜學(xué)規(guī)律，共同解析重疊譜，以獲取重疊組分準(zhǔn)確的定量面積四在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用 影響中醫(yī)藥學(xué)的應(yīng)用和發(fā)展、尤其是中醫(yī)藥進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)的極為重要的因素是中藥的質(zhì)量問(wèn)題目前所用的質(zhì)量控制方法只測(cè)定少數(shù)成分來(lái)控制中藥質(zhì)量，由于中藥發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)是中藥的有效成分，而一味中藥中的有效成分可能是幾種成分，也可能是幾十種成分甚至更多因而目前中藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制尚缺乏可靠、合理、有效