層析柱的一些總結(jié)

1、多數(shù)微生物堿性蛋白酶不耐熱，堿土金屬，特別是鈣對(duì)堿性蛋白酶有明顯的熱穩(wěn)定作用 堿性蛋白酶是加酶洗滌劑的主要添加劑之一，在絲綢、制革工業(yè)中也有廣泛用途熱穩(wěn)定性 將酶液分別置于不同的溫度條件下（30 C，40 C，50 C，60 C，70 C）保溫10min后，立即在0C冰浴中冷卻，然后在 40 C下測(cè)堿性蛋白酶活力，以剩余的酶活性作為評(píng)價(jià)酶的熱穩(wěn)定性的指標(biāo)。100%，分別計(jì)算不同溫度條件下蛋白酶的剩余酶活性與測(cè)量三個(gè)重復(fù)求平均值，將最高的酶活力定義為 最高酶活性的比值。以ph7的緩沖液為例，如果你的目標(biāo)蛋白等電點(diǎn)小于 7,呢就帶負(fù)電荷，用陰離子交換的柱子，如果是大于7,那 選擇陽離子交換的柱子，

2、如果等電點(diǎn)是7,那上樣的緩沖液 pH大于它的等電點(diǎn)用陰離子，小于7的用陽離子, 如此類推就可以緩沖液的PH = pI值+ 1，上陰離子柱，=pI值1，上陽離子柱，一般緩沖液ph范圍在6.58.5之間,與PI值相差1個(gè)PH是比較理想的。如果不清楚PI值，可以將蛋白溶到PH梯度的緩沖液里，然后分別試陽離子和陰離子填料（50ul左右得體積就夠了），看那個(gè)PH下掛得好。強(qiáng)離子交換劑：在寬pH范圍內(nèi)載量穩(wěn)定，所以他的優(yōu)點(diǎn)是不同pH下載量恒定，可控性好，平衡過程快速、 簡(jiǎn)單。5.5 7.5弱離子交換介質(zhì)的缺點(diǎn)：適用的pH范圍比較小，隨著pH不同載量發(fā)生變化。但是大部分蛋白等電點(diǎn)在。因此強(qiáng)/弱離子交換介質(zhì)都

3、可以使用 弱離子交換介質(zhì)（DEAE、ANX、CM）優(yōu)點(diǎn)在于：和強(qiáng)離子交換介質(zhì)的選擇性不同，因此我們一般先使用 強(qiáng)離子交換，如果優(yōu)化條件還是達(dá)不到理想的分離效果，可以嘗試弱離子交換，用選擇性不同的介質(zhì)嘗試 一下。因此弱離子交換與強(qiáng)離子交換由于選擇性不同，可以說是對(duì)不同蛋白的結(jié)合力有差異。技術(shù)規(guī)格離子交換劑類型Q Sep harose FFDEAE Sep harose FFANX Sep harose 4FFSP Sep harose FFCM Se pharose FF離子容量季氨基，強(qiáng)陰離子二乙基氨基乙基，弱陰離子 二乙基氨基丙基，弱陰離子磺丙基，強(qiáng)陽離子羥甲基，弱陽離子Q Sep haro

4、se FFDEAE Sep harose FF0.18-0.25mmol( Cl-) /ml0.11-0.16mmol(Cl- ) /mlANX Sep harose 4 FF0.13-0.18mmol(Cl-)/mlSP Se pharose FF0.18-0.25mmol(H+)/mlCM Se pharose FF動(dòng)態(tài)載量0.09-0.13mmol(H+)/mlQ Sep harose FF120mg HSA/ml填料DEAE Sep harose FFANX Sep harose 4 FF110mg HSA/ml 填料5mg甲狀腺球蛋白/ml填料SP Sep harose FF70mg

5、 RNAase/ml填料CM Se pharose FF50mg RNAase/ml填料壓力/流速Q(mào) Sepharose FF 400-700cm/h，100kpa，XK50/30 層析柱，柱床高 15cmDEAE Sepharose FF 300-600cm/h，100kpa，XK50/30 層析柱，柱床高 15cmSP Sep harose FFANX Sepharose 4 FF 至少 200cm/h ，100kpa ，XK50/60 層析柱，柱床高 25cm 400-700cm/h，100kpa，XK50/30 層析柱，柱床高 15cmCM Se pharose FF300-600cm

6、/h，100kpa，XK50/30 層析柱，柱床高 15cm平均顆粒大小90um (45-165um )基質(zhì)Sep harose FFSep harose 4 FF高度交聯(lián)瓊脂糖，6%高度交聯(lián)瓊脂糖，4%PH穩(wěn)定性Q Sep harose FF1-14（短期），2-12 （長(zhǎng)期）DEAE Sep harose FFANX Sep harose 4 FF1-14（短期），2-13 （長(zhǎng)期）2-14 （短期），3-13 （長(zhǎng)期）SP Sep harose FFCM Se pharose FF3-14（短期），4-13 （長(zhǎng)期）2-14 （短期），4-13 （長(zhǎng)期）化學(xué)穩(wěn)定性在所有常用的水溶液緩沖液

7、中穩(wěn)定：8M尿素、6M鹽酸胍、70%乙醇、1M NaOH 和1M醋酸20%乙醇(Q , DEAE,ANX,CM )，含 0.2M 醋酸鈉的 20% 乙醇(SP)保存保存溫度4 °C -30 °CI 1M NaOH 和醋酸僅在清洗時(shí)使用P henyl-Se pharose HP產(chǎn)品名稱:苯基-瓊脂糖凝膠6FF性 狀:白色微球凝膠類型:疏水層析介質(zhì)45- 165 gm粒 徑：工作PH值：3-13用：疏水層析介質(zhì)，快流速，適合生物大分子和疫苗的分離純化等產(chǎn)品名稱：苯基-瓊脂糖凝膠 H.P.性狀：白色微球凝膠類型：疏水層析填料粒 徑：24- 44 gm工作PH值：3-13用：疏水層

8、析介質(zhì)，高分辨率，適合生物大分子和疫苗的分離純化等產(chǎn)品名稱：苯基-瓊脂糖凝膠 CL-4B性狀：白色微球凝膠類型：疏水層析填料粒 徑：45- 165 gm工作PH值：3-13用：疏水層析介質(zhì)，適合生物大分子和疫苗的分離純化等。產(chǎn)品名稱:丁基-瓊脂糖凝膠4FF性 狀:白色微球凝膠類型:疏水層析介質(zhì)45- 165 gm工作PH值：3-13粒 徑:用：疏水層析介質(zhì)，快流速，適合生物大分子和疫苗的分離純化等產(chǎn)品名稱：丁基-瓊脂糖凝膠 H.P.性狀：白色微球凝膠類型：疏水層析介質(zhì)粒 徑：24- 44 gm工作PH值：3-13用：疏水層析介質(zhì)，高分辨率，適合生物大分子和疫苗的分離純化等產(chǎn)品名稱:丁基-瓊脂糖

9、凝膠 4B性 狀:白色微球凝膠類型:疏水層析介質(zhì)45- 165 gm工作PH值：4-8粒 徑:用：疏水層析介質(zhì)，適合生物大分子和疫苗的分離純化等產(chǎn)品名稱:辛基-瓊脂糖凝膠4FF性 狀:白色微球凝膠類型:疏水層析介質(zhì)45- 165 gm粒 徑：工作PH值：3-13用：疏水層析介質(zhì)，快流速，適合生物大分子和疫苗的分離純化等 產(chǎn)品名稱：辛基-瓊脂糖凝膠 H.P.性狀：白色微球 凝膠類型：疏水層析介質(zhì)粒 徑：24- 44 gm工作PH值：3-13用：疏水層析介質(zhì)，高分辨率，適合生物大分子和疫苗的分離純化等產(chǎn)品名稱：辛基-瓊脂糖凝膠 CL-4B性狀：白色微球 凝膠類型：疏水層析介質(zhì) 粒 徑：45- 16

10、5 gm工作PH值：3-13用：疏水層析介質(zhì)，適合生物大分子和疫苗的分離純化等HPLC內(nèi)容: 1、反相柱子：一般適用范圍比較大。分離極性比較小的物質(zhì)。極性強(qiáng)的物質(zhì)先出柱。ODS就是C18柱子。RP-8和RP-18分別是C18柱子和C8柱子。C18柱子和C8柱子是柱子的碳鏈的長(zhǎng)度不一樣的。碳鏈增長(zhǎng)了，也增加了鍵合相的非極性作用的面積，對(duì)保留值和選擇性都有影響，隨烷基碳鏈的增長(zhǎng)對(duì)溶質(zhì)分 離的選擇性也增強(qiáng)了 .但是對(duì)單一或簡(jiǎn)單組分確實(shí)看不出太大區(qū)別。2、正相柱子：一般分離光學(xué)異構(gòu)體和反相柱子不能分離的極性比較大的物質(zhì)。APS為NH2柱子另外diol代表的是球形硅膠鄰二羥基丙基醇基柱，正相柱，極性強(qiáng)的

11、物質(zhì)后出。硅膠柱子的特點(diǎn)是可分離異構(gòu)體，柱子的載樣量大，用于制備分離，不污染收集的流分了，缺點(diǎn)是分析應(yīng) 用不方便，如流動(dòng)相的含水量應(yīng)該嚴(yán)格控制，再現(xiàn)性較差，需較長(zhǎng)的平衡時(shí)間，不適用于梯度洗脫。堿性化合物在氨基和二醇柱上的保留強(qiáng)，而偶極化合物在腈基柱子上的保留強(qiáng)。 建議您看看色譜分析等專業(yè)書籍有幫助的。ODS-A同時(shí)也是HPLC中應(yīng)用最廣泛的應(yīng)用。YMCODS-A液相色譜柱是國(guó)際上是銷售最好的一種傳統(tǒng)色譜柱，廣泛地應(yīng)用于多種化合物的分離。在嚴(yán)格ODS-A液相色譜采用高度封端的表面結(jié)構(gòu)和具有適當(dāng)?shù)氖杷裕|(zhì)量控制體系下，對(duì) 50個(gè)以上的參數(shù)進(jìn)行嚴(yán)格控制，保證了穩(wěn)定的質(zhì)量。其通常作為液相色譜標(biāo)準(zhǔn)柱。

12、ODS-AMODS-AM 液相色譜柱是一種高碳含量的 C18柱，具有和ODS-A液相色譜柱相似的選擇性。二者的主要區(qū)別是ODS-AM 液相色譜柱采用的是專利的封端技術(shù)，采用十分嚴(yán)格的生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范，可提供優(yōu)良的 峰對(duì)稱性和更高分離效果的重現(xiàn)性，從而改善較難分離組分的峰形。ODS-AQODS-AQ液相色譜填料具有中等強(qiáng)度的疏水性和氫鍵鍵合相色譜填料，由于其具有相對(duì)高的疏水性， 其與ODS-A相比有不同的保留行為，其主要用于碳水化合物的分離，如寡聚多糖類、葡萄糖苷類、藥物 和天然化合物的分離。ODS-ALODS-AL液相色譜柱不僅具有疏水基團(tuán)的相互作用，其與傳統(tǒng)的ODS不同的選擇性。當(dāng)離子間相互作用

13、被優(yōu)分離，可以獲得高重現(xiàn)性的色譜圖。YMC-P ack ODS-AL而且還具備由硅醇基產(chǎn)生的第二級(jí)相互作用，這使化后，特別推薦用于流動(dòng)相中含有緩沖液的色譜 液相色譜柱采用的是沒有封端的高碳含量單層由于容易發(fā)生拖尾峰，不推薦在分析胺類或ODS H80, M80, L80ODS液相色譜填料是一種以硅膠為載體的三種配基覆蓋率不同的C18相，其只能在殘存的硅醇基活性有利于色譜分離時(shí)使用, 含堿性基團(tuán)的化合物中使用。ODS填料，不同配基覆蓋率將影響?zhàn)s出 物中疏水組分的保留行為，餾出物的官能基團(tuán)或三級(jí)結(jié)構(gòu)將決定分離行為的結(jié)果。J's phere ODS液相色譜如離子或相互作用，其多用于分離條件的測(cè)

14、定。填料幾乎不需要考慮疏水性和氫鍵鍵合相之間的相互作用,色譜柱考慮的問題首先是填料的問題，大多數(shù)用于HPLC分離的柱填料使用硅膠填料，基于多孔聚合物擔(dān) 體與鍵和的有機(jī)表層 (如C18 & C8)，應(yīng)用范圍較廣，顆粒的大小(粒 度)在HPLC中極為重要，約5um 的微粒直徑兼顧了分析柱的柱效，反壓和壽命。更小的多孔微粒對(duì)快速分離很有用。小至1.5um的薄殼微粒對(duì)極快速地分 離蛋白質(zhì)等大分子較有用。 較窄地粒度分布能保證填充床地穩(wěn)定、高效和壓力降最小。的來說，3或5um全多孔微球填充HPLC色譜柱，能滿足大多數(shù)分離地需要。色譜柱地反壓,C18填料,而C18鏈形成的反相固定色譜柱地性能指標(biāo)主

15、要考慮： 理論塔板數(shù)，峰不對(duì)稱因子(AS)，兩種不同溶質(zhì)地選擇性, 保留值地重現(xiàn)性，鍵和相濃度，色譜柱地穩(wěn)定性。有幾點(diǎn)看法：1) 本人認(rèn)為,C18是連接了 18烷基碳鏈的反相固定相的總稱.ODS是以硅膠為基質(zhì)鍵合的 還包括其他基質(zhì)的填料，比如高聚物小球?yàn)榛|(zhì)，氧化鋁為基質(zhì)，氧化鋯為基質(zhì)等鍵合 C18相,這些可以稱為"C18",但是不是ODS.2) RP-18也是C18中的一種，不同的公司對(duì) C18填料有不同的商業(yè)名稱，本質(zhì)應(yīng)該都是一樣的.Merck公司的填料喜歡叫 RP-18.比如 Merck 的 LiChrospher RP-18, Superspher RP-18,Pu

16、rospher RP-18.因此，我認(rèn)為說"RP-18"是改進(jìn)型的不妥當(dāng).Merck的改進(jìn)表現(xiàn)在前邊的名字上，比如LiCHrospher, Superspher, Purospher表現(xiàn)的是不同的性能.3) "普通ODS分析酸性、中性或弱堿性化合物時(shí)均可以獲得較佳的峰不對(duì)稱度。但當(dāng)分析藥物化合物中的強(qiáng)極性含氮的堿性樣品時(shí)，樣品峰形就極差，拖尾嚴(yán)重，定量分析精度下降",這句話我認(rèn)為值得商榷.普通的ODS,在分離中性化合物，極弱性的酸或鹼化合物的時(shí)候可以得到較好的峰形，對(duì)于弱至中等極性的酸堿化合物,多數(shù)情況下會(huì)出現(xiàn)不同程度的拖尾.對(duì)于強(qiáng)極性化合物，不單是藥物

17、，其他化合物一樣，都會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的 拖尾現(xiàn)象再次修改，除掉了不太相關(guān)的BDS，應(yīng)該說論述比較全面了。C18(C-18)、RP 18(RP-18)、ODS 有什么區(qū)別？答：C18(C-18)、ODS、RP 18(RP-18)的寫法一般人從表面上理解沒多大的區(qū)別，三者之間常?；煊?，但 在具體的不同場(chǎng)合，從嚴(yán)格意義上講，還是有一定的區(qū)別。除了硅膠基質(zhì)外，還可以包括其他基質(zhì)的填料，C18鏈形成的反相固定相。C18柱是硅膠基質(zhì)，因此，在很多場(chǎng)合內(nèi)二者混一般認(rèn)為C18是連接了 18烷基碳鏈的反相固定相的總稱， 比如高聚物小球?yàn)榛|(zhì)，氧化鋁為基質(zhì)，氧化鋯為基質(zhì)等鍵合 而ODS是以硅膠為基質(zhì)鍵合的 C18填料。因?yàn)榇蟛糠值?為一體。ODS其后所標(biāo)的1、2、3、4、5有的是指含碳的不同，有的是不同代的替換產(chǎn)品， 如Spherisorb的ODS-1 是指未經(jīng)封尾處理的，含碳量為5.75%，ODS-2是經(jīng)封尾處理的，含碳量為11.5%。不同廠家的ODS柱性 能差異很大。RP在不同廠