生物分離工程期末答案

1、精品文檔1歡。迎下載期末考試復(fù)習(xí)題吸附法和離子交換1、吸附作用機(jī)理是什么？按作用力可分為哪幾種？答：固體表面分子 （ 或原子 ）處于特殊的狀態(tài)。 固體內(nèi)部分子所受的力是對(duì)稱的，故彼此處于平衡。但在界面分子的力場(chǎng)是不飽和的， 即存在一種固體的表面 力，它能從外界吸附分子、原子、或離子，并在吸附表面上形成多分子層或單分 子層。按作用力可分為：物理吸附，化學(xué)吸附和離子交換2、吸附法有幾種？各自有何特點(diǎn)？答：吸附法按吸附作用力分主要有三類，物理吸附、化學(xué)吸附和離子交 換。特點(diǎn)：物理吸附基于吸附劑與溶質(zhì)之間的分子間作用力即范德華力。 溶質(zhì)在吸附劑 上吸附與否或吸附量的多少主要取決于溶質(zhì)與吸附劑極性的相似

2、性和溶劑的極 性。一般物理吸附發(fā)生在吸附劑的整個(gè)自由表面， 被吸附的溶質(zhì)可通過改變溫度、 PH 和鹽濃度等物理?xiàng)l件脫附?；瘜W(xué)吸附釋放大量的熱， 吸附熱高于物理吸附。 化學(xué)吸附一般為單分子層吸 附，吸附穩(wěn)定， 不易脫附， 故洗脫化學(xué)吸附質(zhì)一般需采用破壞化學(xué)結(jié)合的化學(xué)試 劑為洗脫劑?；瘜W(xué)吸附具有高選擇性離子交換吸附所用吸附劑為離子交換劑。 離子交換劑表面含有離子基團(tuán)或可 離子化基團(tuán)，通過靜電引力吸附帶有相反電荷的離子，吸附過程發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移。 離子交換的吸附質(zhì)可以通過調(diào)節(jié) PH 或提高離子強(qiáng)度的方法洗脫。3、大孔網(wǎng)狀聚合物吸附與活性炭吸附劑相比有何優(yōu)缺點(diǎn)？ 答：大孔網(wǎng)狀聚合物吸附劑機(jī)械強(qiáng)度高，使用壽

3、命長，選擇性能好，吸附質(zhì) 容易吸附，并且阻力小，常應(yīng)用于抗精品文檔2歡。迎下載生素和維生素 B12 等的分離濃縮過程。4、影響吸附過程的因素有那些？答：影響吸附的因素（1）吸附速度由于大分子分子量大， 擴(kuò)散慢，且吸附時(shí)常伴隨著分子構(gòu)型的變化，故其吸 附速度慢，這就給討論大分子吸附帶來困難。（2）分子量的影響對(duì)孔性固體， 分子量增加，吸附量減少。對(duì)大孔或非孔固體a =1 只有 1 個(gè)吸附點(diǎn) a =0 表示大分子完全平躺。（3）溶劑的影響在溶劑中，大分子較伸展，吸附量減少。 若溶劑產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)吸附，吸附量減 少。（4） 溫度的影響 存在著溫度升高使吸附量下降和溫度升高使吸附量升高兩種情況。第二種情 況

4、可認(rèn)為吸附是吸熱過程 Ho,但厶 G Af . = 4弔rlJ?芒1”, t心乙二巧 bn 憲全分離 尺或14一完命戴分幵4、 色層圖中分離度有哪幾種表示方法？見課本 p 169分辨率表示法 R=2(9 R2B R1)/(W1+W2)容量因子表示法 k = m H選擇性表示法 a= K2 /K1 柱效表示5、 層析劑有那幾種？各自有何特點(diǎn)？疏水性吸附劑，金屬螯合層析劑，二硫鍵層析劑，凝膠，硅膠等反向介質(zhì)6、何謂親和色層分離法？親和力的本質(zhì)是什么？親和色層中常用的親和關(guān)系有那幾種？答：(1)利用生物分子間的這種特異性結(jié)合作用的原理進(jìn)行生物物質(zhì)分離 純化的技術(shù)稱為親和純化技術(shù)(Affinity p

5、urification)。親和層析是利用偶聯(lián)親和配基的親和吸附介質(zhì)為固定相親和吸附目標(biāo)產(chǎn)物，使目標(biāo)產(chǎn)物得到分離純 化精品文檔9歡迎下載的液相層析法。(2) 親和力的本質(zhì)：1.靜電作用：親和作用分子對(duì)的結(jié)合部位上帶有相反電荷時(shí)，產(chǎn)生靜電引力。在中性 pH 下，蛋白質(zhì)分子上酸性氨基酸殘基可帶負(fù)電 荷，堿性氨基酸殘基可帶正電荷。此外 N 末端氨基酸的:-氨基帶正電，C 末端氨 基酸的羧基帶負(fù)電。2.氫鍵：如果親和作用分子對(duì)的一方分子中含有氧原子或 氮原子，結(jié)合部位之間可以產(chǎn)生氫鍵作用，即形成0 H O 或 0 HN。氫鍵的產(chǎn)生與否受結(jié)合部位之間位置關(guān)系的嚴(yán)格制約。3.疏水性相互作用：如果 親和作用分

6、子對(duì)的一方分子上含有芳香環(huán)或烴基鏈等疏水基，另一方的結(jié)合部位上也含有疏水區(qū)，則兩者之間可發(fā)生疏水性相互作用。4.配位鍵：如果親和作用分子對(duì)均與同一金屬原子配位， 則兩者之間可通過金屬配位鍵間接結(jié)合。 5.弱 共價(jià)鍵：弱共價(jià)鍵是指結(jié)合力較弱的可逆共價(jià)鍵。當(dāng)親和作用分子對(duì)之間滿足形成弱共價(jià)鍵的條件時(shí)可能形成弱共價(jià)鍵。具有親和作用的分子對(duì)之間具有“鑰匙”和“鎖孔”的空間結(jié)構(gòu)關(guān)系。(3) 親和色層中常用的親和體系：特異性親和作用體系高特異性抗原-單克隆抗體荷爾蒙受體蛋白核酸-互補(bǔ)堿基鏈段、核酸結(jié)合蛋白 酶-底物、產(chǎn)物、抑制劑群特異性免疫球蛋白A 蛋白、G 蛋白酶-輔酶凝集素-糖、糖蛋白、細(xì)胞、細(xì)胞表面

7、受體酶、蛋白質(zhì)-肝素酶、蛋白質(zhì)-活性色素(染料)酶、蛋白質(zhì)-過度金屬離子酶、蛋白質(zhì)-氨基酸(組氨酸等)7、柱層析法與固定床吸附法有何異同點(diǎn)？相同點(diǎn)：操作過程中都存在兩相，即固定相和流動(dòng)相。都能對(duì)溶質(zhì)分子起到 分離精品文檔10歡迎下載作用。不同點(diǎn)：操作完成后，層析法的目標(biāo)產(chǎn)物仍然存在于流動(dòng)相中，只是由于洗 出時(shí)間的不同而在不同時(shí)間得到不同產(chǎn)物，溶質(zhì)的分離程度由分辨率判斷；固定 床吸附法的吸附物存在于固相中（即由液相或氣相轉(zhuǎn)移到固相），產(chǎn)物的分離純度取決于吸附劑的分離性質(zhì)。操作方法上，柱層析是間歇操作，而固定床吸附是連續(xù)操作。在完成操作后， 層析柱可以開始下一次分離，而固定床吸附法在達(dá)到穿透點(diǎn)之后

8、需要停止吸附操 作，轉(zhuǎn)入吸附質(zhì)洗脫和吸附劑再生操作。&色譜柱理論板數(shù)和塔板高度的計(jì)算？答：根據(jù)呈正態(tài)分布的色譜流出曲線可以導(dǎo)出計(jì)算塔板數(shù)n 的公式，用以評(píng)H-5.54（尸-16（ f價(jià)一根柱子的柱效。由于色譜柱并無真正的塔板，故塔板數(shù)又稱理論塔板數(shù)：可見理論塔板數(shù)由組分保留值和峰寬決定。若柱長為 L，則每塊理論塔板高度 H 為H丄n由上述兩式知道，理論塔板數(shù) n 越多、理論塔板高度越小、色譜峰越窄，則柱效越咼。但上述兩式包含死時(shí)間 to,它與組分在柱內(nèi)的分配無關(guān)，因此不能真正反映rf%=久旳f-尸=“d聲winw色譜柱的柱效。通常以有效塔板數(shù) nef 和有效塔板高度 Hef 表示精品文檔11歡

9、迎下載9、常用的親和吸附介質(zhì)有哪些?答：（1）酶的抑制劑酶的抑制劑有天然的生物大分子， 也有小分子化合物。 例如胰蛋白酶的天然 蛋白質(zhì)類抑制劑有胰臟蛋白酶抑制劑 (pancreatic trypsin inhibitor; PTI) 等， 小分子抑制劑有芐脒( benzamidine )、精氨酸和賴氨酸等，均可作為親和純化胰 蛋白酶的配基。(2)抗體利用抗體為配基的親和色譜又稱免疫親和色譜(immuno- affinitychromatography)?？贵w與抗原之間的 Keq 般為 1071012 L/mol。因此，利 用免疫親和色譜法是高度純化蛋白質(zhì)類生物大分子的有效手段。(3) A 蛋白

10、protein A 為分子量約 42 kD 的蛋白質(zhì)，與 IgG 具有很強(qiáng)的親和作用，結(jié) 合部位為IgG 分子的 Fc 片段。A 蛋白分子上含有 5 個(gè) Fc 片段可結(jié)合部位。不同 IgG 的 Fc 片段的結(jié)構(gòu)非常相似，因此 A 蛋白可作為各種抗體的親和配 基，但不同抗體的結(jié)合常數(shù)有所不同。A 蛋白與抗體結(jié)合并不影響抗體與抗原的結(jié)合能力，因此A 蛋白也可用于分離抗原 - 抗體的免疫復(fù)合體。(4)凝集素凝集素( lectin )是與糖特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)(酶和抗體除外)的總稱。伴刀豆球蛋白 A(concanavalin A ， con A) 可用做糖蛋白、多糖、糖脂等 含糖生物大分子的分析、純化。

11、pH5.6 時(shí)為四聚體，分子量為 102 kD，兩個(gè)亞基(subunit )之間通過二硫鍵 結(jié)合。因此，在利用con A 為配基的親和色譜操作中，操作條件應(yīng)當(dāng)適宜。( 5)輔酶和磷酸腺苷脫氫酶和激酶與輔酶之間具有親和結(jié)合作用。 輔酶主要有 NA(Dnicotinamideadenine dinucleotide )、 NADP( NAD phosphate ) 和 ATP( adenosine triphosphate )等。這些輔酶可用做脫氫酶和激酶的親和配基。AMP (adenosine 5-monophosphate) 、 ADP( adenosine 2 ， 5-diphosphate

12、 ) 的腺苷部分與上述輔酶的結(jié)構(gòu)類似，可用做這些酶的親和配基。精品文檔12歡。迎下載( 6) 三嗪類色素利用色素為配基的親和色譜法又稱色素親和色譜( Dye-ligand affinitychromatography ）。Triazinedyes 是一類分子內(nèi)含有三嗪環(huán)的合成染料，與 NAD 的結(jié)合部位相同，又稱為生體模擬色素（ biomimetic dye ）。除脫氫酶和激酶外，三嗪類色素 還與血清白蛋白、干擾素、核酸酶和糖解酶等具有很高的親和力。（7） 過渡金屬離子Cu2+ ，Ni2+, Zn2+和 Co2+等過渡金屬離子可通過與亞胺二乙酸（IDA）或 三羧甲基乙二胺（TED 形成螯合金屬

13、鹽固定在固定相粒子表面，用做親和吸附 蛋白質(zhì)的配基。這種利用金屬離子為配基的親和色譜一般稱為金屬螯合色譜（metalchelate chromatography ）或固定化金屬離子親和色譜 （immobilized metal affinitychromato-graphy, IMAC） 。（ 8 ）組氨酸組氨酸可與蛋白質(zhì)發(fā)生親和結(jié)合作用： 靜電和疏水性相互作用均有可能參與 親和結(jié)合。在鹽濃度較低和 pH 約等于目標(biāo)蛋白質(zhì) pl 的溶液中，固定化組氨酸的親和吸 附作用最強(qiáng)，隨著鹽濃度增大，親和吸附作用降低。（ 9 ）肝素肝素（ heparin ）是存在于哺乳動(dòng)物的肝、肺、腸等臟器中的酸性多糖類

14、物質(zhì)，分子量一般為 5 至 30 kD，具有抗凝血作用。肝素與脂蛋白、脂肪酶、甾體受體、限制性核酸內(nèi)切酶、抗凝血酶、凝血蛋 白質(zhì)等具有親和作用，可用作這些物質(zhì)的親和配基。肝素的親和結(jié)合作用在中性 pH 和低濃度鹽溶液中較強(qiáng)，隨著鹽濃度的增大 結(jié)合作用降低10、親和層析中目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫有哪幾種方法？各有何優(yōu)缺點(diǎn)？答：特異性洗脫利用含有與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物具有親和結(jié)合作用的小分子 化合物溶液為洗脫劑， 通過與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合， 脫附目標(biāo)產(chǎn)物， 洗脫條件溫和， 有利于保護(hù)目標(biāo)產(chǎn)物的生物活性，另外， 由于僅特異性洗脫目標(biāo) 產(chǎn)物，精品文檔13歡。迎下載對(duì)特異性較低的體系或非特異性吸附較嚴(yán)重

15、的物系， 特異性洗脫法有利于精品文檔14歡。迎下載提高目標(biāo)產(chǎn)物的純度。非特異性洗脫是通過調(diào)節(jié) pH 值、離子強(qiáng)度、離子種類和溫度等理化性質(zhì)降低 目標(biāo)產(chǎn)物的親和吸附作用，是較多采用的洗脫方法。優(yōu)點(diǎn)為成本低，速度快，吸 附介質(zhì)再生容易。缺點(diǎn)是洗脫體積大，目標(biāo)產(chǎn)物在洗脫中濃度較低。如果要提高 濃度或是配基與目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)合較強(qiáng)時(shí)，要選擇適當(dāng)?shù)?pHfi 及離子強(qiáng)度或加入變性 劑，如果選擇不當(dāng)，可能造成目標(biāo)產(chǎn)物失活。電泳1、 電泳的概念答：帶電質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中向帶有異相電荷的電極遷移的現(xiàn)象稱為電泳。2、 電泳的基本原理V v=u-=uE一一L答：電泳分離利用荷電溶質(zhì)在電場(chǎng)中泳動(dòng)速度的差別進(jìn)行分離3、電泳技術(shù)的

16、分類答：有區(qū)帶電泳、等電點(diǎn)電泳和等速電泳。這些電泳法又根據(jù)是否使用凝膠載體分為凝膠電泳和自由流電泳。賞怵電泳Ii . . . j1I輸末電訥 紙堪冰st膠電訛吐泳色甯梟靈電漂II4、基本的電泳系統(tǒng)組成電源、電極、成形盤、膠梳、膠槽、外蓋5、常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離原理能粉電禰球腑睛電冰墨丙嫦椎胺電滋等電盪粧電沐密度梆度電謙親和電就精品文檔15歡迎下載答：常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可形成大小不同的孔徑，具 有很強(qiáng)的分子篩作用。電泳利用凝膠的分子篩作用使分子大小或帶電荷不同的 電解質(zhì)得到分離：相對(duì)分子質(zhì)量大的溶質(zhì)受凝膠的阻滯作用大，泳動(dòng)速度較慢， 而小分子溶質(zhì)泳動(dòng)速度較快。6、 SD

17、S- PAGE 勺分離原理答：SDS-PAG 引進(jìn)陰離子表面活性劑 SDS（十二烷基磺酸鈉）。SDSf 蛋白質(zhì) 勺疏水部位結(jié)合，能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)勺二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)， 強(qiáng)還原劑能使半胱氨酸之間勺二硫鍵斷裂，減少了蛋白質(zhì)分子之間勺聚集作用。蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的 SD 溶液中，與 SD 分子按比例結(jié)合，形成帶 負(fù)電荷的 SDS 蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的 SDS 使蛋白質(zhì)喪失了 原有的電荷狀態(tài)， 形成僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊， 從而降低或消 除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于 SD 與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成 比例的，因此在進(jìn)行電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。7、 何謂等電聚焦？如何形成載體兩性電解質(zhì) pH 梯度？在凝膠中加入兩性電解質(zhì)（如 Amnpholine）,通電后，凝膠中構(gòu)成從正極到負(fù) 極逐漸增加的 pH 梯度,處在其中的蛋白分子在電場(chǎng)的作用下運(yùn)動(dòng)，最后各自停留 在其等電點(diǎn)的位置上 , 利用氣壓力將已等電聚焦的樣品推動(dòng) , 經(jīng)過檢測(cè)器進(jìn)行檢 測(cè)。兩性電解質(zhì)為數(shù)百至數(shù)千種混合物， 各個(gè)組分具有不同的等電點(diǎn)， 所以在通 電以后，能夠形成載體兩性電解質(zhì) pH 梯度。作業(yè)摘抄：精品文檔16