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文檔簡介

1、精選優(yōu)質文檔-傾情為你奉上PCR引物設計原則引物(Primer)是人工合成的兩段寡核苷酸序列。1、 引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不應大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74，不適于Taq DNA聚合酶進行反應。2、 G十C含量：應在40%-60%之間，PCR擴增中的復性溫度一般是較低Tm值引物的Tm值減去5-10度。引物長度小于20時，其Tm恒等于4(G十C)十2(A十T)。3、 堿基分布的隨機性：應避免連續(xù)出現(xiàn)4個以上的單一堿基。尤其是不應在其3端出現(xiàn)超過3個的連續(xù)G或C，否則會使引物在G十C富集序列區(qū)錯誤引發(fā).4、 引物自身：不能含有自身互補序列，否則會形成

2、發(fā)夾樣二級結構.5、 引物之間：兩個引物之間不應有多于4個的互補或同源堿基，不然會形成引物二聚體，尤應避免3端的互補重疊。引物3端最好選T，錯配的幾率與A相比大大的降低了。G、C之間錯配的概率小于A、T.6、引物的5端可以修飾，而3端不能進行修飾。5端的修飾包括：加酶切位點，標記生物素，熒光，地高辛、Eu3+等，引入蛋白質結合的DNA序列，引入點突變，插入突變、缺失突變序列、引入啟動子序列。因為引物的延伸是從3端開始的，因而3端不能進行任何修飾，另外3端也不能有形成任何二級結構的可能。如何設計引物不同的核苷酸序列表達的氨基酸氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。引物最好在模板cDN

3、A的保守區(qū)域內設計（DNA的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的，在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件比對（Alignment）,各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)）。PCR引物設計PCR反應中有兩條引物，即5端引物和3引物。設計引物時以一條DNA單鏈為基準（常以信息鏈為基準），5端引物與位于待擴增片段5端上的一小段DNA序列相同；3端引物與位于待擴增片段3端的一小段DNA序列互補。引物設計軟件Primer Premier5.0 （自動搜索）*vOligo6 （引物評價）vVector NTI SuitvDNAsisvOmigavDNAstarvPrimer3 （在線服務）PCR常見問題PCR產物的電泳檢測時間一般為48h以內，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶。PCR反應的關鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質量與

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