蛋白質(zhì)相互作用組學(xué)分析技術(shù)

1、個人收集整理僅供參考學(xué)習(xí)為探究生物進程的分子機制，需要確定介導(dǎo)這個過程的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì) 間的相互作用。研究蛋白質(zhì)間相互作用的主要技術(shù)總結(jié)如下: 一、酵母雙雜交系統(tǒng) 酵母雙雜交系統(tǒng)是當(dāng)前廣泛用于蛋白質(zhì)相互作用組學(xué)研究的一種重 要方法。其原理是當(dāng)靶蛋白和誘餌蛋白特異結(jié)合后，誘餌蛋白結(jié)合于 報道基因的啟動子，啟動報道 基因在酵母細胞內(nèi)的表達，如果檢測 到報道基因的表達產(chǎn)物，則說明兩者之間有相互作用，反之則兩者之間沒有相互作用。將這種技術(shù)微量化、陣列化后則可用于大規(guī)模蛋 白質(zhì)之間相互作用的研究。在實際工作中，人們根據(jù)需要發(fā)展了單雜交系統(tǒng)、三雜交系統(tǒng)和反向雜交系統(tǒng)等。An germayr等設(shè)計了一個SO

2、S蛋白介導(dǎo)的雙雜交系統(tǒng)?？梢匝芯磕さ鞍椎墓δ?，豐富了酵母雙雜交系統(tǒng)的功能。此外，酵母雙雜交系統(tǒng)的作用也已擴展至對蛋白 質(zhì)的鑒定。二、噬茵體展示技術(shù)在編碼噬菌體外殼蛋站因上連接一單克隆抗體的DNA序列，當(dāng)噬菌體生長時，表面就表達出相應(yīng)的單抗，再將噬菌體過柱，柱上若含 目的蛋白就會與相應(yīng)抗體 特異性結(jié)合，這被稱為噬菌體展示技術(shù)。此技術(shù)也主要用于研究蛋辿之間的相互作用，不僅有高通量及簡便的特點，還具有直接得到基因、高選擇性的篩選復(fù)雜混合物、在篩 選過程中通過適當(dāng)改變條件可以直接評價相互結(jié)合的特異性等優(yōu)點。目前，用優(yōu)化的噬菌體展示技術(shù)，已經(jīng)展示了人和鼠的兩種特殊細胞 系的cDNA文 庫，并分離出了人上

3、皮生長因子信號傳導(dǎo)途徑中的信 號分子。三、等離子共振技術(shù) 表 面等離子共振技術(shù)（Surface Plasmon Resonance ，SPR）已成為蛋 白質(zhì)相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一種納米級的薄膜吸附上“誘餌蛋白,”當(dāng)待測蛋白與誘餌蛋白結(jié)合后，薄膜的共振性質(zhì)會 發(fā)生改變，通過檢測便可知這兩種蛋白的結(jié)合情況。 SPR技術(shù)的優(yōu)點是不需標(biāo)記物或染料，反應(yīng)過程可實時監(jiān)控。測定快速且安全，還可 用于檢測 蛋白一核酸及其它生物大分子之間的相互作用。四、熒光能量轉(zhuǎn)移技術(shù) 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET ）廣泛用于研究分子間的距離及其相互 作用；與熒光顯微鏡結(jié)合，可定量獲取有關(guān)生物活體內(nèi)蛋白質(zhì)、 脂

4、類、DNA和RNA的時空信息。隨著綠色熒光蛋白（GFP）的發(fā)展，F(xiàn)RET熒光顯微鏡有可能實時測量活體細胞內(nèi)分子的動態(tài)性質(zhì)。提出了一種 定量測量FRET效率以及供體與受體間距離的簡單方法，僅需使用一 組濾光片和測量一個比 值，利用供體和受體的發(fā)射譜消除光譜間的 串?dāng)_。該方法簡單快速，可實時定量測量FRET的效率和供體與受體 間的距離，尤其適用于基于 GFP的供體受體對。五、抗體與蛋白質(zhì)陣列技術(shù)蛋 白芯片技術(shù)的出現(xiàn)給蛋白質(zhì)組學(xué)研究帶來新的思路。蛋白質(zhì)組學(xué) 研究中一個主要的內(nèi)容就是研究在不同生理狀態(tài)下蛋白水平的量變, 微型化，集成化，高通量化的抗 體芯片就是一個非常好的研究工具, 他也是芯片中發(fā)展最

5、快的芯片，而且在技術(shù)上已經(jīng)日益成熟。這些抗體芯片有的已經(jīng)在向臨床應(yīng)用上發(fā)展，比如腫瘤標(biāo)志物抗體芯片等, 還有很多已經(jīng)應(yīng)用再眼就的各個領(lǐng)域里。六、免疫共沉淀技術(shù) 免 疫共沉淀主要是用來研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相 互作用的一種技術(shù)，其基本原理是，在細胞裂解液中加入抗興趣蛋白的抗體，孵育后再加入與抗體特異結(jié)合的結(jié)合于Pan sobin珠上的金黃色葡萄球菌蛋白 A(SPA),若細胞中有正與興趣蛋白結(jié)合的目的蛋白，就可以形成這樣一種復(fù)合物：“目的蛋白一興趣蛋白一抗興 趣蛋白 抗體一SP A| Pan sob in :因為SPA|Pan sobin比較大，這樣復(fù)合物在離心時就被分離出來。經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

6、，復(fù)合物四組分 又被分開。然后經(jīng) Western blotting法，用抗體檢測目的蛋白是什么,是否為預(yù)測蛋白。這種方法得到的目的蛋白是在細胞內(nèi)天然與興趣蛋 白結(jié)合的，符合體內(nèi)實際情況，得到的蛋 可信度高。但這種方法 有兩個缺陷：一是兩種蛋應(yīng)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第 三者在中間起橋梁作用；二是必須在實驗前預(yù)測目的蛋囲什么，以 選擇 最后檢測的抗體，所以，若預(yù)測不正確，實驗就得不到結(jié)果, 方法本身具有冒險性。七、Pull-down 技術(shù)蛋白質(zhì)相互作用的類型有牢固型相互作用和暫時型相互作用兩種。牢固型相互作用以多亞基蛋白復(fù)合體常見，最好通過免疫共沉淀(Co-1 P ) 、Pull-down 技術(shù)或 Far-western 法研究。Pull-down 技術(shù)用固相化的、已標(biāo)記的餌蛋進標(biāo)簽蛋白（生物素-、PolyHis