竹節(jié)參總皂苷對腦缺血再灌注模型海馬組織一氧化氮合酶的影響

1、竹節(jié)參總皂苷對腦缺血再灌注模型海馬組織一氧化氮合酶的影響        【摘要】     目的 觀察竹節(jié)參總皂苷(total rhizoma panacis japonica saponins,tRPJS)對反復(fù)腦缺血再灌注小鼠及局灶性腦缺血再灌注大鼠海馬組織一氧化氮合酶(NOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的影響,探討藥物抗腦缺血損傷的作用機(jī)制。方法 插線法阻塞大腦中動脈(MCAO)制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型,采用反復(fù)夾閉雙側(cè)頸總動脈的方法造成小鼠腦缺血再

2、灌注模型,研究tRPJS對這兩種腦缺血再灌注損傷模型海馬組織NOS、iNOS的影響。結(jié)果 tRPJS能顯著降低腦缺血再灌注損傷小鼠和局灶性腦缺血大鼠海馬組織NOS、iNOS的含量(P<0.05)。結(jié)論 tRPJS抗腦缺血損傷與降低海馬組織NOS、iNOS的活性有關(guān)。     【關(guān)鍵詞】  竹節(jié)參總皂苷；腦缺血；一氧化氮合酶    Effects of Total Rhizoma Panacis Japonica Saponins on Nitric Oxide Synthase of Hippoca

3、mpus Region in the Mouse Repetitious Cerebral Ischemia Reperfusion and the Rat Focal Cerebral Ischemia  ZHAO Hui, ZOU Hai-yan, XU Meng, et al1.College of TCM, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100013, China；2.School of Chinese pharmacy, Beijing University of TCM, Beijing 100102, C

4、hina    Abstract：Objective To study the mechanism of protective effects of total rhizoma panacis japonica saponins (tRPJS) on the cerebral ischemia injury. Methods The middle cerebral artery occlusion model (MCAO) in rats and cerebral ischemia-reperfusion models in mice were used to i

5、nvestigate the influence of tRPJS on the nitric oxide synthase (NOS) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) activity in hippocampus region. Results tRPJS significantly decreased the contents of NOS and iNOS in hippocampus region of MCAO rat and cerebral ischemia reinfusion mouse. Conclusion tRPJ

6、S has significantly protective effects by decreasing NOS and iNOS.    Key words：total thizoma panacis japonica saponins；cerebral ischemia；nitric oxide synthase    大量研究表明,一氧化氮(NO)在急性腦缺血損傷中具有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)毒性兩種不同作用1。NO的雙重作用除與自身復(fù)雜的理化、生物學(xué)特性有關(guān)外,一氧化氮合酶(NOS)作為NO合成過程中的重要限速酶,是決定其雙重作用的關(guān)鍵

7、因素。目前,誘導(dǎo)型NOS(iNOS)被認(rèn)為是一種“病理型的酶”,在免疫刺激后表達(dá),持續(xù)產(chǎn)生的NO與細(xì)胞毒作用有關(guān)2。海馬是腦組織中對缺血、缺氧最敏感的區(qū)域之一,NOS及iNOS活力的變化與海馬神經(jīng)元的損傷具有相關(guān)性。通過檢測反復(fù)腦缺血再灌注小鼠及局灶性腦缺血再灌注大鼠這兩種腦缺血損傷模型的海馬組織NOS及iNOS活力的變化,探討竹節(jié)參總皂苷(total rhizoma panacis japonica saponins,tRPJS)抗腦缺血損傷的作用機(jī)理。1  實(shí)驗(yàn)材料1.1  動物    ICL雄性小鼠,清潔級,體重2530 g,首都醫(yī)科大學(xué)

8、動物中心提供,合格證號：scxkc(京)72000-0012；SD雄性大鼠,清潔級,體重280300 g,北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供,合格證號：SCXK11-00-0008。1.2  藥物與試劑    tPRJS,首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供,臨用前以生理鹽水稀釋至所需濃度。NOS測定試劑盒、蛋白質(zhì)測定試劑盒(考馬斯亮蘭法)均購自南京建成生物工程研究所。1.3  儀器    752N型分光光度計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；TGL-16g型高速臺式離心機(jī),上海醫(yī)用分析儀器廠生產(chǎn)；AEG-22

9、0電子分析天平,日本Shimadzu公司；DY89-1型電動玻璃勻漿機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司。2  實(shí)驗(yàn)方法2.1  反復(fù)腦缺血再灌注小鼠模型的制備    小鼠麻醉,仰臥固定,頸正中切口,分離雙側(cè)頸總動脈及伴行神經(jīng),用動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈,缺血20 min后松開雙側(cè)動脈夾,恢復(fù)腦血流20 min,如此反復(fù)操作3次,最后恢復(fù)供血,縫合皮膚。假手術(shù)組小鼠麻醉后,僅暴露雙側(cè)頸總動脈,不進(jìn)行腦缺血再灌注。術(shù)中、術(shù)后室溫控制在2425 。動物麻醉清醒后(術(shù)后約60 min)進(jìn)行神經(jīng)功能損害評分3,如分值在2分或2分以上則認(rèn)為模型制作成功并納入實(shí)

10、驗(yàn)研究。2.2  局灶性腦缺血再灌注大鼠模型的制備    參照Koizumi法4制作大腦中動脈栓塞(MCAO)模型。大鼠麻醉,仰臥固定,頸正中切口,依次暴露右側(cè)頸總、頸外和頸內(nèi)動脈,結(jié)扎頸總動脈、頸外動脈,于頸總動脈分叉下方剪一切口,將預(yù)先用酒精燈燒成圓頭的尼龍線(長4 cm,直徑0.25 mm)置于頸內(nèi)動脈1718 mm,到有輕微阻力感為止,扎緊動脈殘端,縫合皮膚,缺血2 h后,將尼龍線輕輕撥出再灌。假手術(shù)組大鼠麻醉后,僅暴露頸內(nèi)外動脈分支,不閉塞大腦中動脈。術(shù)中、術(shù)后室溫嚴(yán)格控制在2425 ,大鼠體溫維持在36.537.5 。采用Bederson等5

11、介紹的神經(jīng)功能評分法對麻醉清醒后(術(shù)后約70 min)的大鼠進(jìn)行評分,如分值在2分或2分以上則認(rèn)為模型制作成功并納入實(shí)驗(yàn)研究。2.3  分組及給藥反復(fù)腦缺血再灌小鼠模型制備成功后,將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為5組,即假手術(shù)對照組、模型組及tRPJS組(260、130、65 mg/kg)。用藥組先腹腔注射給藥2 d,第3天給藥后20 min施行手術(shù),術(shù)后每8 h給藥1次。假手術(shù)對照組、模型組腹腔注射等量的生理鹽水。局灶性腦缺血再灌大鼠模型制備完成后,將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為5組,即假手術(shù)對照組、模型組及tRPJS組(200、100、50 mg/kg)。用藥組先腹腔注射給藥2 d,第3 d給藥后20 m

12、in施行手術(shù),術(shù)后每8 h給藥1次。假手術(shù)對照組、模型組腹腔注射等量的生理鹽水。2.4  腦組織勻漿的制備反復(fù)腦缺血再灌小鼠術(shù)后24 h斷頭處死,迅速放入冰盒中分離各組小鼠的海馬組織。局灶性腦缺血再灌大鼠再灌22 h后斷頭處死,在冰浴中分離大鼠缺血側(cè)海馬(右側(cè))。分離后的海馬組織均稱重后放入預(yù)冰的生理鹽水中,冰浴中制成10%的組織勻漿,3 000 r/min離心10 min,取上清。按NOS及蛋白質(zhì)測定試劑盒說明書分別進(jìn)行測定。2.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示,均使用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件,進(jìn)行方差分析。3  結(jié)果(見表1、表2)表1

13、0; tRPJS對反復(fù)腦缺血再灌注小鼠海馬組織NOS、iNOS含量的影響(略)注：與假手術(shù)組比較,*P<0.05；與模型組比較,#P<0.05(下同)。表2  tRPJS對局灶性腦缺血大鼠海馬組織NOS、iNOS的影響(略)4  討論    NO作為信使分子對腦缺血疾病的作用研究已相當(dāng)廣泛,在腦缺血早期短暫的NO增高,可以通過擴(kuò)張血管維持腦血流,防止血小板和白細(xì)胞的聚集與粘附及下調(diào)N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體而起到神經(jīng)保護(hù)作用。但在腦缺血亞急性期,隨著NO的大量產(chǎn)生,缺血腦組織通過NMDA受體介導(dǎo)谷氨酸神經(jīng)毒性作用,發(fā)揮N

14、O的細(xì)胞毒作用6。正是由于NO作用的雙重性,研究腦缺血過程中不同功能的NOS及其產(chǎn)物NO的作用將有助于臨床腦缺血損傷的治療。目前比較一致的看法是,缺血早期NO主要由原生型NOS(cNOS)合成,它對維持血管內(nèi)皮功能、抗白細(xì)胞粘附和維持腦微循環(huán)通暢有益,過早抑制cNOS合成NO可加重缺血性腦損傷；腦缺血和(或)再灌注12 h4 d時腦組織NO主要由誘生型(iNOS)合成,由iNOS所產(chǎn)生的NO可能直接或者通過其衍生物導(dǎo)致能量耗竭,促進(jìn)DNA的損害,抑制DNA的合成,誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡,增加缺血后興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放而加重缺血性損害,應(yīng)用iNOS抑制劑可明顯減輕腦損傷。本實(shí)驗(yàn)觀察到,反復(fù)腦缺血再灌

15、小鼠及局灶性腦缺血再灌大鼠在缺血損傷24 h后,海馬組織NOS明顯升高,特別是iNOS與假手術(shù)組相比升高顯著。這就進(jìn)一步證實(shí)iNOS的活性增高、NO的過度生成與缺血性損傷有密切關(guān)系。tRPJS是從五加科植物竹節(jié)參Panax Japonicus C.A Meyer根莖中提取的主要有效活性部位,其主要成分包括竹節(jié)人參皂苷(chikusetsu- sapnin)、,人參皂苷(ginsenoside) Rd、Re、Rg1、Rg2 ,三七皂苷R2(notoginsenosideR2)。本室前期的藥理實(shí)驗(yàn)證明,tRPJS對腦缺血動物模型有很好的保護(hù)作用,利用反復(fù)腦缺血再灌注小鼠及局灶性腦缺血再灌大鼠這兩種

16、腦缺血損傷模型,我們發(fā)現(xiàn),tRPJS能明顯降低腦缺血損傷動物海馬組織NOS、iNOS的活性(P<0.05),表明tRPJS保護(hù)腦缺血損傷的機(jī)理與阻抑NOS、iNOS的過度表達(dá)有關(guān)。    【參考文獻(xiàn)】  1 陳 琳,高 署,胡成穆,等.一氧化氮及一氧化氮合酶在腦缺血損傷中的作用J.安徽醫(yī)藥,2004,2(8)：5.2 Dawso VL,Dawson TM,Batley DA,et al. Mechanism of nitric oxide mediated neurotoxity in primarty brain culturesJ.N

17、eurosic,1993,13(6)：26512661.3 翁鴻博,馬 濤.葛根黃苷元對腦缺血的保護(hù)作用及機(jī)理探討J.中國藥理學(xué)通報(bào),1999,15(6)：534536.4 KoizumiJ,Yoshida Y,Nakaazawa T,et al.Experimental studies of ischemic brain edemata new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic areaJ.Stroke,1986,8：18.5 Bederson JB,Pitts LH,Tsuji M,et al.Rat middle cerebral artery occlusion：e