灝洋生物向您介紹幾種細(xì)胞的分離方法

1、（生物科技行業(yè)）激洋生物向您介紹幾種細(xì)胞的分離方法2020年5月多年的企業(yè)咨洵顧問(wèn)屋儂,經(jīng)過(guò)實(shí)戰(zhàn)驗(yàn)證可以落地執(zhí)i亍的卓越管理方窠，值得您下我擁有激洋生物向您介紹幾種細(xì)胞的分離方法：白細(xì)的胞分離：（加速紅細(xì)胞沉降法）加速紅細(xì)胞沉降法利用高分子量的聚合物促使紅細(xì)胞凝聚成串錢狀，從而加速紅細(xì)胞沉降，使之與白細(xì)胞分離。常用的高分子聚合物有明膠、右旋糖酊、聚乙烯此咯烷酮（PVP）及甲基纖維素等。（1）試劑及配制3%明膠（激洋生物產(chǎn)）（粘度為25泊以上）：選取優(yōu)質(zhì)明膠，用生理鹽水配成3%溶液，置沸水浴加熱溶解，分裝，高壓蒸汽滅菌8磅15-20min.6%右旋糖酊（激洋生物產(chǎn)）（分子量200-400KD）:

2、用生理鹽水配制。操作方法分為2種。第一種：取抗凝靜脈血加入等量3%明膠鹽水溶液中，混勻或用3份血7與1份3%明膠溶液混勻；將試管直立靜置室溫或37c溫箱中30-60min,利用明膠與紅細(xì)胞的粘合作用，促使紅細(xì)胞快速下沉，而白細(xì)胞留在明膠溶液中；用毛細(xì)吸管吸取富含白細(xì)胞的上層液，移入另一試管中；按自然沉降法-操作。第二種：取1份右旋糖酊溶液加等量抗凝血，混勻；按操作方法1的-操作。外周血單個(gè)核細(xì)胞分離試劑：（聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法）外周血中單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，其體積、形狀和比重與其他細(xì)胞不同，紅細(xì)胞和多核細(xì)胞比重較大，為1.092左右，而淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞比重為

3、1.075左右。利用比重1.077左右的分層液作密度梯度離心，使一定比重的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。1試劑及配制聚蔗糖泛影葡胺分層液（LTS1077）:（激洋生物有成品供應(yīng)），比重為1.077±0.001臺(tái)盼藍(lán)染液：稱取4g臺(tái)盼藍(lán)，于研缽中用少量雙蒸水研磨，加雙蒸水至100ml,1500r/min離心15min,吸出上層液，即為4%水溶液。用前，1.8%氯化鈉溶液1倍，即為2%臺(tái)盼藍(lán)染液。2.操作方法取靜脈血放入抗凝管，搖允，用Ph7.2-7.6Hank液稀釋血液1-2倍。取LTS1077聚蔗糖-泛影葡胺分層液（灝洋生物產(chǎn)）3-4ml,放入15X150mm試管

4、中。用毛吸管吸取稀釋血液，在離分層液上1cm處，沿試管壁徐徐加入，使稀釋血液重疊于分層液上，稀釋血液與分層液體積比例約為2：1。用水平離心機(jī)以2000r/min離心30min,離心后管內(nèi)容物分為三層，上層為血漿（內(nèi)含血小板），中間層為分層液，底層為紅細(xì)胞和多核白細(xì)胞。在上、中層液體界面處可見(jiàn)到乳白色渾濁的單個(gè)核細(xì)胞層。用毛細(xì)吸管輕輕插到白膜層，沿試管壁周緣吸取界面層單個(gè)核細(xì)胞，移入另一試管中。加5倍以上體積不含Ca2+、Mg2+Hank液，混勻，1500r/min離心10min,吸棄上清，重復(fù)洗滌2次。末次離心后，吸盡上清。按每毫升血液標(biāo)本加0.2ml含20%小牛血清Hank液重新混懸細(xì)胞。取

5、1滴細(xì)胞懸液置血球計(jì)數(shù)板內(nèi)計(jì)數(shù)。然后細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至2X106/ml細(xì)胞活力檢測(cè)：取1滴細(xì)胞懸液加1滴2%臺(tái)盼藍(lán)染液混勻，加蓋片，顯微鏡高倍鏡檢。活細(xì)胞不著色，折光強(qiáng)；死細(xì)胞被染成藍(lán)色，體積略膨大?；罴?xì)胞數(shù)應(yīng)在95%以上3.注意事項(xiàng)用稀釋后的全血可是單個(gè)核細(xì)胞得率高，將稀釋的血液疊加于分層液上時(shí)，一定要細(xì)心，動(dòng)作要輕，避免沖散分層液面或與分層液混合而影響分離結(jié)果。配制單個(gè)核細(xì)胞懸液所用的培養(yǎng)液要求等滲，具緩沖作用，并對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性。吸取單個(gè)核細(xì)胞時(shí)，應(yīng)避免吸出過(guò)多上清液或分層液而導(dǎo)致血小板污染。配制好的單個(gè)核細(xì)胞可放室溫或0-4C,后一條件較好，可減低細(xì)胞代謝活動(dòng)。注意不要迅速改變其所出的溫度，以

6、免造成“溫度”休克。通用型細(xì)胞分離液（LTS1130）的比重的配方（激洋生物產(chǎn)）取比重LTS1077的人淋巴細(xì)胞分離液（激洋生物產(chǎn)）3ml,放入15X150mm試管中。用PBS將肝素抗凝血稀釋1-2倍后，將稀釋全血加到LTS1077分離液上，稀釋的血液：分離液約為2:1。用水平離心機(jī)以1500r/min離心10min,離心后，單個(gè)核細(xì)胞位于血漿和分離液的界面層，紅細(xì)胞和粒細(xì)胞沉淀在分離液層下，一部分單核細(xì)胞和血小板位于分離液層上。吸取界面單個(gè)核細(xì)胞層，用PBS洗三次。用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液重疊單個(gè)核細(xì)胞，配成所需濃度的細(xì)胞。用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢查細(xì)胞活力。NK細(xì)胞分離試劑：細(xì)胞分離液不連續(xù)梯度分離法通用型

7、細(xì)胞（LTS1130）分離液，為無(wú)毒、無(wú)刺激的新型密度梯度離心分離劑。其在離心過(guò)程中會(huì)自然形成密度梯度，從而將不同密度的細(xì)胞分離出來(lái)。1.試劑及配制pH7.2檸檬酸鹽緩沖液檸檬酸327mg檸檬酸鈉2.63g磷酸氫鈉222mg葡萄糖2.55mg蒸播水加到100ml（2）聚蔗糖-泛影葡胺分層液（LTS1077）（d=1.077±0.001）通用型細(xì)胞分離液LTS1130（激洋生物產(chǎn)）產(chǎn)品（4）Hank液（含5%小牛血清）2.操作方法外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離取外周血于檸檬酸鹽緩沖7中，兩者體積比為7:1。離心，1000r/min,10min,棄上清，注意勿觸及細(xì)胞沉淀。用吸管小心吸取細(xì)胞沉淀

8、上面富含白細(xì)胞的部分。以3倍體積的Hank液稀釋細(xì)胞，置于聚蔗糖-泛影葡胺分層液（LTS1077）上，2000r/min,20min.小心吸取界面白細(xì)胞部分，用Hank液洗2次，配成（0.5-1）x108細(xì)胞/ml.非連續(xù)細(xì)胞分離液（LTS1130）密度梯度離心制備7種不同的細(xì)胞分層液，范圍為40%-57.5%，每梯度相差2.5%，即40%、42.5%、45%>47.5%、50%、52.5%、55%、57.5%將不同密度的細(xì)胞分離液輕輕地一層層鋪起，從高密度至低密度加，最后加1ml細(xì)胞懸液于頂部。離心，2000r/min,30min.小心吸取第二、三部分的細(xì)胞。第一部分是頂部液體與40%

9、細(xì)胞分離液之間，第二部分是40%與42.5%細(xì)胞分離液之間，第三部分是42.5%與45%的細(xì)胞分離液之間，這兩部富含NK細(xì)胞。用Hank液洗2次，1000r/min,10min,細(xì)胞重懸于Hank液中，4c存放備用。3 .結(jié)果觀察通過(guò)形態(tài)學(xué)分析，細(xì)胞分離液密度梯度離心分離的NK細(xì)胞80%為L(zhǎng)GL,細(xì)胞活力95%。4 .鑒定用CD56、CD57單抗間接免疫熒光法鑒定純度，臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)存活率。5 .注意事項(xiàng)血標(biāo)本應(yīng)新鮮，宜在4c下分離細(xì)胞，以保持細(xì)胞活力。一般用檸檬酸鹽抗凝，可能檸檬酸鹽能更有效阻斷補(bǔ)體系統(tǒng)在體外活。單核細(xì)胞分離試齊I：密度分離法密度梯度離心法單核細(xì)胞只占末梢血白細(xì)胞的3%-5%

10、，比重與淋巴細(xì)胞近似。用離心法很難將兩者分開。一般利用對(duì)塑料的粘著作用來(lái)分離單核和淋巴細(xì)胞，將粘附的細(xì)胞用機(jī)械的或酶作用的方法剝離并富集。但此法有損傷細(xì)胞及回收率低等缺點(diǎn)。先可用以下兩種方法獲得量多較純的單核細(xì)胞。1 .Colotta方法試劑及配制pH7.2PBS液。聚蔗糖-泛影葡胺分層液（LTS1077）（激洋生物產(chǎn)品）（d=1.077）10%小牛血清，25mmol/LHepesRPMI-1640培養(yǎng)液（Ph7.2）。46%細(xì)胞分離液。操作方法將用PBS5倍稀釋的肝素抗凝血40ml,疊加在10ml分層液上，室溫，400r/min20min。分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞，用PBS離心洗2次，再用PB

11、S懸浮。150r/min離心10min,除去血小板，于沉淀中加入5ml含10%小牛血清及25mmol/Lhepes的RPMI-1640液，制成5ml的懸液。將其加在46%的細(xì)胞分離液5ml中，室溫，550r/min離心30min后得到3個(gè)帶：第1帶為富集單核細(xì)胞層（83%）；第2帶也有少量單個(gè)核細(xì)胞；第3帶為淋巴細(xì)胞。收集第1、2帶細(xì)胞。2 密度梯度離心法試劑及配制A液：90g/L聚蔗糖15ml,加500g/L泛影葡胺10m1（比重1.14）（激洋生物產(chǎn)品LTS1140）B液：90g/L聚蔗糖17.5ml,加500g/L泛影葡胺10m1（比重1.13）（激洋生物產(chǎn)品LTS1130）C液：90g

12、/L聚蔗糖20ml,加500g/L泛影葡胺10ml（比重1.12）（激洋生物產(chǎn)品LTS1120）D液：90g/L聚蔗糖24ml,加500g/L泛影葡胺10ml（比重1.08）（激洋生物產(chǎn)品LTS1080）操作方法在10ml離心管中依次加入A、B、C、D4液各2ml,制成梯度。于D液上重疊以生理鹽水2倍稀釋的肝素抗凝血2ml,1000r/min離心40min。在血漿與D液的界面為單核細(xì)胞層（純度97%-100%)吸出單核細(xì)胞層人外周血中性粒細(xì)胞分離試劑：小量分離和大量分離1 .小量分離法（1）試劑及配制6%右旋糖酊生理鹽水。聚蔗糖-泛影葡胺分層液（LTS1077）（激洋生物產(chǎn)品）（d=1.077

13、g/ml）。0.83%NH4CL溶液：取0.83gNH4CL、0.1gKHCO3、0.0037gEDTANa2,蒸播水力口至100ml。P3-170.1%白明膠Hank液。（2）操作方法取3-10ml肝素抗凝靜脈血，加1/4體積的6%右旋酊生理鹽水，混勻后在室溫斜置30-45min,使紅細(xì)胞下沉。取上層按1:1比例疊加到聚蔗糖-泛影葡胺分離液面上（LTS1077）（激洋生物產(chǎn)品），500r/min離心30min。將沉淀細(xì)胞用0.83%NH4CL溶液破除紅細(xì)胞，離心洗滌后懸于2-3ml0.1%白明膠Hank液中，計(jì)數(shù)并調(diào)整濃度。取細(xì)胞液涂片，分別作臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)和Giemsa染色，鑒定其存活率與

14、純度。2 .大量中性粒細(xì)胞的分離法（1）試劑和配制通用型細(xì)胞分離液（LTS1130）:將購(gòu)買的LTS1130分離液用10XHBSS（無(wú)鈣、鎂）按9:1的體積比配成貯存液，該濃度被認(rèn)為100%o再用1XHBSS(含10mmol/LHepes,Ph7.2)將100%的LTS1130分離液稀釋成81%、70%和55%的濃度備用，其密度分別為1.100、1.0875和1.0697。(2)葡聚糖：將DextraT-500用PBS配成4%的濃度。(3)離心梯度的配制：取17X100mm的離心管(Falcon)，將5ml81%的LTS1130分離液加入管底，然后依次加入3ml70%LTS1130分離液和4m

15、l55%LTS1130分離液即可。(2)操作方法將全血3000r/min離心3.25min。取40ml淡黃色細(xì)胞層(buffycoat)與4%Dextran混合。5min后將80ml2%Dextran加入懸液中，然后將懸液倒入50ml的離心管中，讓其自然沉淀30min。取Dextran沉淀后的"上?t部分”，150g離心8min,并用PBS洗滌2次。將細(xì)胞(約5-80X106/ml)加入梯度離心的最上層(即55%分離液層)，用水平轉(zhuǎn)頭10C,1600r/min離心20min。離心后將產(chǎn)生3條細(xì)胞帶，其中帶2中性粒細(xì)胞約占96.5%o取出細(xì)胞，用HBSS洗滌后配成所需濃度。樹突狀細(xì)胞分

16、離試劑-兩種方法方法一(1)試劑及配制分離單個(gè)核細(xì)胞所需試劑。5%小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液。無(wú)Ca2+、Mg2+PBS。彳E化環(huán)實(shí)驗(yàn)所需試劑。人免疫球蛋白(Ig)(10mg/ml)。牛血漿白蛋白(BPA),密度p=1.082o牛血漿白蛋白(BPA)p=1.047o(2)操作方法肝素抗凝血用聚蔗糖-泛影胺分層液分離單個(gè)核細(xì)胞，用無(wú)Ca2+Mg2+PBA洗3次，去除血小板，用含5%小牛血¥tRPMI-1640液配成5X107/ml。將單個(gè)核細(xì)胞與經(jīng)神經(jīng)氨酸酶(NA)處理過(guò)的羊紅細(xì)胞(E,SRBC)做總E花環(huán)實(shí)驗(yàn)，用分層液離心去除其中的T細(xì)胞。E花環(huán)陰性細(xì)胞用RPMI-1640洗兩

17、次，制成(3-5)X106/ml細(xì)胞懸液，置于100mm塑料平皿中，在5%CO237孵箱中培養(yǎng)2h，傾出培養(yǎng)液，再用1640培養(yǎng)液洗2次，以除去非粘附細(xì)胞。貼壁細(xì)胞加入5%小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液在37繼續(xù)培養(yǎng)16h，此時(shí)多數(shù)單核細(xì)胞仍牢固粘附于平皿上，而樹突狀細(xì)胞則脫粘附，輕搖之。收集非粘附細(xì)胞，用Ig包被板再粘附法純化DC:將人Ig(10mg/ml)加入塑料平皿中，室溫下置20-30min，然后傾出Ig,用冷PBS洗2次，將非粘附細(xì)胞(3X10ml)加入包被皿中，37c孵育30min,除去混雜的Fc受體陽(yáng)性（FCR+）單核細(xì)胞（粘附于皿上）。P3-18用牛血清白蛋白（BSA）不連續(xù)

18、密度梯度離心分離B細(xì)胞和樹突細(xì)胞：將（2-4）X107細(xì)胞重懸于4mlp=1.082的BPA,在其上疊加2mlp=1.047的BPA,以10000r/min離心15min（4C進(jìn)行），低密度細(xì)胞位于界面層，高密度細(xì)胞（主要為B細(xì)胞和NK細(xì)胞）沉于管底。低密度細(xì)胞為純化的樹突狀細(xì)胞，洗滌后重懸于5%小牛血清1640液中，用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞活力。注意事項(xiàng)：為得到較高純度的DC，可用包被抗-Ig的紅細(xì)胞、單核細(xì)胞與包被抗紅細(xì)胞抗體（溶血素）的紅細(xì)胞以形成花環(huán)的方法去除B細(xì)胞和單核細(xì)胞；也可將T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞分別與其相應(yīng)抗體及補(bǔ)體做細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)加以去除，通過(guò)密度梯度離心得到純化的DC。方法二

19、（1）主要試劑 Ficoll-Hypaque分離液 Percoll Verapamil（維爾帕米）人IgRPMI-1640S-100蛋白NaphtholAS-biphosphate（2）操作方法分離周邊血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）:按用Ficoll-Hypaque液分離出PBMC,用D-Hank液洗滌2次。用RPMI-1640液洗滌1次。加Verapamil后分離DC：每mlPBMC中力口入verapamil20山室溫下置30min。用Percoll密度梯度離心，取50%界面層細(xì)胞。用D-Hank液洗2次，用RPMI-1640洗滌1次，備用。用Panning法進(jìn)一步純化DC。將人Ig（10mg/m

20、l）加入克隆板孔中（1ml/孔，4C,30min）,然后傾入Ig,用冷PBS洗2次。將上述備用的細(xì)胞懸液加入克隆板孔（1ml/孔，4，1h），輕輕吹打，收集非粘附細(xì)胞，用D-Hank液洗3次，以上加人Ig作對(duì)照。（3）鑒定：用抗S-100蛋白抗體進(jìn)行鑒定，本方法可得到純度為93%的DC。紅細(xì)胞的分離試劑P167將抗凝血離心沉淀，洗滌，去除血小板和白細(xì)胞，得到下層紅細(xì)胞。（1） 試劑及配制0.9%NaCl無(wú)Ca2+，Mg2+Hank液。（2）操作方法取抗凝血加等量生理鹽水，混勻，2000r/min離心5min,去上清。用無(wú)Ca2+,Mg2+Hank液將紅細(xì)胞洗滌3次，前兩次2000r/min,5

21、min,末次2000r/min10min,去上清。將壓積紅細(xì)胞配成所需濃度。骨髓抽吸物中的單個(gè)核細(xì)胞分離試劑：利用骨髓抽吸物種各種細(xì)的比重不同，通過(guò)密度梯度離心使單個(gè)核細(xì)胞得以分離。1.試劑及配制(1)無(wú)Ca2+,Mg2+HBSS。(2)35%、30%、25%、20%、15%蔗糖：用含20%小牛血清的HBSS配制為密度梯度介質(zhì)。(3)枸檬酸-枸檬酸鹽溶液：2.92g枸檬酸、9.16g枸檬酸鈉加蒸播水至400ml。(4)氯化鏤(NH4C1)溶血溶液：8.29gNH4Cl、1.00gKHCO3、0.0372gEDTANa2蒸播水力口至1000ml。2.操作方法(1)用裝有0.5ml枸檬酸的注射器吸

22、取2.5-3.0ml骨髓抽吸物。(2)將骨髓抽吸物放入尖底試管中，與10ml0.83%NH4Cl溶液混合，使紅細(xì)胞溶解，用吸管將細(xì)胞懸液吹打2min使紅細(xì)胞充分溶解，加入適量無(wú)Ca2+、Mg2+的HBSS,600g離心5min。(3)傾去上清液，重復(fù)洗滌一次。(4)傾去上清液，將細(xì)胞重懸于2mlHBSS中，小心地疊加于由35%、30%、25%、20%、15%蔗糖各2ml組成的密度梯度上。(5)200g離心7min.(6)用吸管吸出上半部分液體，置于另一試管中，加入5倍體積無(wú) Ca2+、Mg2+ 的HBSS, 600g離心5min(7)重復(fù)洗滌1次。(8)吸出或傾出上清液，將細(xì)胞重懸，使其濃度為107/ml。脾，淋巴結(jié)或扁桃體中單個(gè)核細(xì)胞分離試劑：1 .試劑及配制(1)無(wú)Ca2+,Mg+PBSS2 2)5%小牛血清RPMI-16402.操作方法(1)將一個(gè)無(wú)菌塑料平皿裝入足量HBSS(應(yīng)蓋住皿底)，用平頭鐐子把組織細(xì)胞壓出，經(jīng)(100目)金屬網(wǎng)過(guò)濾，制成細(xì)胞懸液。(2