GST標(biāo)記蛋白質(zhì)微量純化試劑盒使用說明

1、GST 標(biāo)記蛋白質(zhì)微量純化試劑盒 GST 標(biāo)記蛋白質(zhì)微量純化試劑盒簡介:重組蛋白 N 端的 GST 谷胱甘肽 S 轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S Transferase 能提高重組蛋白的水溶 性,所以常用于蛋白質(zhì)重組表達(dá)。 GST-谷胱甘肽親和層析是利用 GST 標(biāo)記的蛋白能與谷胱甘肽層 析介質(zhì)結(jié)合,并能被還原型谷胱甘肽洗脫的特點(diǎn)而建立,是目前分離純化 GST 標(biāo)記蛋白質(zhì)的重要 方法。 GST 標(biāo)記蛋白質(zhì)微量純化試劑盒使用方法:注意:1. 每步得到的樣品最好都留存少量作為 SDS-PAGE 分析的對照,在下面描述中就不再提醒。2. GST 標(biāo)記蛋白質(zhì)微量純化試劑盒實(shí)驗(yàn)需要用到的 1

2、5;PBS 緩沖液可用自備的超純水稀釋本試劑 盒提供 10×PBS 緩沖液而得。 PBS 緩沖液用超純水稀釋后極其容易長細(xì)菌,注意防止污染。3. GST 洗脫液的配制方法是將約 80mg GST 洗脫液成分二干粉全部加入到 GST 洗脫液成分一 溶液中,搖晃直到干粉全部溶解即得 GST 洗脫液,分裝成小份放 -20保存,每次用一管。一 :重組蛋白的表達(dá)和細(xì)菌收集1. 37振蕩培養(yǎng) 20 mL含表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)菌到 OD600=0.6-0.8。2. 加 IPTG 到終濃度為 0.1 mM, 30振蕩培養(yǎng) 3 小時(shí)或 22振蕩培養(yǎng) 8 小時(shí)(或過夜。3. 4 5000 g 離心 10 分鐘收

3、集 20 mL表達(dá)菌液,棄上清。4. 用 1×PBS 緩沖液重懸細(xì)菌沉淀, 4 5000 g 離心 10 分鐘,棄上清。沉淀可直接用于裂解或 放 -80保存。二:細(xì)胞裂解5. 如果用 GST 標(biāo)記蛋白質(zhì)微量純化試劑盒 A 型, 用 1 mL冰浴的新鮮配制的細(xì)胞裂解液 (1 mL 1×PBS 緩沖液 +50 uL溶液 A+ 25 uL 10 mg/mL 的 PMSF 溶液重懸細(xì)菌沉淀,冰上超聲裂解菌體直 到在顯微鏡下看見絕大多數(shù)細(xì)胞破裂。超聲參數(shù)需根據(jù)儀器型號自行摸索,一般選 1K-10K 頻率處 理 15 次,每次 20 秒,間隔 1 分鐘(必需放置在冰上。裂解物不能粘稠,

4、否則會堵塞層析柱。 6. 如果用 GST 標(biāo)記蛋白質(zhì)微量純化試劑盒 B 型, 在 1 mL 冰浴的新鮮配制的細(xì)胞裂解液 (在 20 mL 1×PBS 緩沖液中加入所有 30 mg 溶菌酶干粉, 溶解后分裝成 1 mL/管, 取一管使用, 剩余的 -20放置中加入 25 uL 10 mg/mL 的 PMSF 溶液和 1 uLBenzonase,用此混合液重懸細(xì)菌沉淀后冰上 放置 30 分鐘,得到細(xì)菌裂解物。7. 將超聲或酶法細(xì)胞裂解物在 13000 g 4離心 10 分鐘去除未裂解細(xì)胞和裂解細(xì)胞碎片以防堵柱, 所得上清即含可溶性 GST 標(biāo)記蛋白。三:層析柱的制備和 GST 蛋白純化8

5、. 搖晃將谷胱甘肽 -Agarose 介質(zhì)充分混勻后,取適量加入到預(yù)放了一片篩板的層析柱中(介質(zhì)用 量需要根據(jù) GST 蛋白產(chǎn)量決定, 100 mL 菌液一般使用 200 uL介質(zhì)即可。下列步驟各溶液的用 量均針對 200 uL介質(zhì)而定,如果介質(zhì)用量不同,各溶液用量需相應(yīng)調(diào)整。9. 用 5 mL 預(yù)冷的 1×PBS 緩沖液洗柱。10. 第 7 步得到的上清液(含可溶性 GST 標(biāo)記蛋白上柱,讓重力使上柱液自然流出,收集并保 存穿透液用于 SDS-PAGE 電泳。 GST 和谷胱甘肽之間的結(jié)合很緩慢,所以流速一定不能快,否則 結(jié)合不充分。流速一般在 0.2-1 mL/分鐘即可。如要提高

6、 GST 標(biāo)記蛋白與介質(zhì)的結(jié)合效率,可用本 試劑盒提供的紅蓋將層析柱下的漏液口堵上,讓細(xì)菌裂解液和介質(zhì)在 4結(jié)合 30 分鐘或過夜。也 可以將穿透液反復(fù)上柱。11. 用 0.5-2 mL 1×PBS 緩沖液洗柱,收集并保存穿透液(含雜蛋白。12. 用 0.2-1 mL GST 洗脫液洗柱,收集并保存穿透液(含 GST 標(biāo)記蛋白。由于可能含蛋白酶污 染,所以穿透液不能在 4放置,需立即用于后續(xù)處理(如濃度測定或 SDS-PAGE 電泳或 -80 長期放置。13. 對收集的 2 種穿透液和洗脫液進(jìn)行蛋白定量或 SDS-PAGE 分析。注意:如果不預(yù)先脫鹽,則 只能用 Bradford 法

7、或 OD 檢測法 (1 OD280 約等于 0.5 mg/mL 蛋白 測定穿透液和洗脫液的蛋白 濃度。 由于 GST 的分子量為 26 KD, 所以在 SDS-PAGE 膠上, GST 標(biāo)記蛋白將比天然蛋白大 26 KD 。附:GST 柱的恢復(fù)(本試劑盒不含所需試劑1. 用 3 倍體積的 6 M 鹽酸胍處理柱子 10 分鐘。2. 用 3 倍體積的超純水處理柱子 10 分鐘。3. 用 3 倍體積的緩沖液一(0.5 M NaCl, 0.1 M TrisHCl, pH 8.5處理柱子 10 分鐘。4. 用 3 倍體積的緩沖液二(0.5 M NaCl, 0.1 M TrisHCl, pH 4.5處理柱子 10 分鐘。5. 再重復(fù) 3-4 步兩次。6. 用 3 倍體積的超純水處理柱子 3 次。7