mRNA及蛋白質的檢測分析技術

1、mRNA及蛋白質的檢測分析技術    mRNA及蛋白質的檢測分析技術移植腎損傷的分子病理學研究已經(jīng)超出局部病理變化的范疇,正在向局部分子改變和組織學改變相結合、代寫碩士論文局部分子改變與體液分子改變及血細胞分子改變相結合的多元化分子研究發(fā)展1。目前研究分子病理的常用方法普遍適用于移植腎損傷的分子病理學研究。  1.DNA檢測分析技術分子生物學技術的發(fā)展,使人們對移植免疫等方面參與移植腎損傷的分子的核苷酸堿基序列的了解越來越清楚。體外基因擴增技術PCR方法的創(chuàng)立及其在生物醫(yī)學中的應用,使得從DNA水平研究移植腎損傷成為可能,并已在臨床器官移植研究

2、中實際應用。檢測DNA的方法多種多樣,根據(jù)不同的用途各有其特點。目前常用的可大致歸納為如下幾大類型2。1.1Southern印跡法(Southern blot)將一定量的DNA樣品用適當?shù)南拗菩詢惹忻盖懈畛刹煌L度的DNA片段,然后在瓊脂糖凝膠上進行電泳分離,如加樣量相等,酶解適當,則在用溴化乙錠染色時,應顯示長度及亮度均相等的DNA拖帶。用于檢測DNA的已知探針,一般由帶有該片段的細菌質粒中制備。純化的探針DNA一般用放射性同位素32P或生物素、地高辛配基等標記。雜交前探針必須加溫至100變性處理。雜交后的膜在暗盒中進行放射自顯影后,即在一定的位置顯示同標記探針特異地結合的陽性DNA條帶。S

3、outhern雜交法可檢測基因的存在及其擴增,也可檢測基因的雜合性丟失。1.2聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)技術PCR是一種由特定寡核苷酸引物(primer)介導的特異基因或克隆序列的體外酶促擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優(yōu)點。該方法一改傳統(tǒng)分子克隆技術的模式,不通過活細胞,操作簡便,可以將數(shù)量很少的原始模板DNA分子進行幾何級數(shù)的倍增,擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定,能最大程度地滿足科學家操作DNA的要求。因此,在其問世后的十多年里,PCR技術得到了迅速發(fā)展。在經(jīng)典PCR基礎上發(fā)展了RT-PCR,

4、以RNA為模板,首先逆轉錄成cDNA,然后進行正常PCR循環(huán)擴增。近年來,PCR技術得到進一步發(fā)展,并建立了一系列PCR擴增新技術,如反向-PCR、錨定-PCR、原位-PCR、巢式-PCR、重組-PCR、定量-PCR等。據(jù)此,在移植腎損傷的分子機制研究中,利用很少的活檢組織細胞或體液,在獲取少量模板DNA的情況下,即可應用PCR技術研究待測基因的表達。1.3聚合酶鏈反應寡核苷酸探針雜交方法(PCR with seqequence-specific oligonucleotide probe, PCR-SSO)PCR-SSO主要技術包括提取模板DNA,以位點間或組間特異引物進行PCR擴增,其產物

5、轉移到NC膜上。再與數(shù)十個寡核苷酸特異性探針雜交,從而分辨出等位基因的特異性。近年來,PCR-SSO的方法學研究有許多改進,標記探針亦多種多樣。歸納起來可分兩大類:放射性標記,主要是32P標記;非放射性標記,常見的有酶類、地高辛、生物素、熒光素或化學發(fā)光劑等,采用PCR-SSO從DNA水平研究移植腎損傷機制已經(jīng)廣泛應用。1.4聚合酶鏈反應單鏈構象多態(tài)性分析(PCR with signgle strand conformation polymorphism, PCR-SSCP)PCR-SSCP系Drita等1989年首先提出,其原理可概括為:在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時,單鏈DNA因

6、堿基序列不同所形成的構象不同。通過PCR擴增包括發(fā)生單個堿基置換部位及兩側DNA片段,變性后進行SSCP分析,從理論上講可分辨出單個堿基的改變,有效地檢出點突變和DNA的多態(tài)性,并且已經(jīng)用于腎移植術后排斥反應的分子病理研究3。1.5順序特異引物聚合酶鏈反應技術(PCR with sequence-specific primers, PCR-SSP)PCR-SSP方法的基本原理是根據(jù)待測基因的核苷酸序列,設計出一系列針對各亞型的順序特異引物,通過PCR擴增各等位基因的型別特異性DNA片段;擴增產物僅需借助常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳,即可根據(jù)是否存在特異性擴增產物的電泳條帶直接進行基因檢測。1.6原位聚

7、合酶鏈反應(in situ PCR)利用PCR技術,不僅可以在聚丙烯管中對含有多種模板的材料進行PCR,也可以在病理切片或細胞顯微波片上對標本進行待測基因的DNA原位擴增,可稱為玻片PCR(Slide-PCR)。其特點是不經(jīng)過模板提取過程,在組織或細胞原位進行PCR擴增,要求在具備原位PCR擴增條件的PCR儀和原位擴增系統(tǒng)中進行,擴增物可作原位雜交顯示,可以結合病理組織學分析,判定病理改變與某個或某些基因的關系。  2.mRNA檢測分析技術2.1原位雜交技術原位雜交(in situ hybridization, ISH)是應用已知堿基順序并帶有標記物的核酸探針與組織、細胞中待測的核酸

8、按堿基配對的原則進行特異結合,形成雜交體,然后再應用與標記物相應的檢測系統(tǒng),通過組織化學或免疫組織化學方法,在核酸原有的位置進行細胞內定位。是研究單一細胞中編碼各種蛋白質、多肽的相應mRNA的定位的手段,是從分子水平研究細胞內基因表達及其調控的有效工具。適用于腎移植后不同病理損傷的mRNA表達的研究及檢測,具有定位準確,病理分析與分子改變同步顯示的功能。22Northern印跡法Northern印跡(Northern blot)原理與Southern blot基本相同。所不同處在于,RNA遠不如DNA穩(wěn)定,很容易被RNA酶降解,而RNA酶不僅廣泛存在,而且加熱至100也不能使其滅活,所以在操作

9、RNA時所用的一切器皿和溶液都必需經(jīng)過嚴格的消除RNA酶的處理。Northern印跡主要應用于檢測相關基因的過度表達,也可檢測基因的低表達或不表達。2.3RT-PCR技術(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)RT-PCR已經(jīng)成為研究器官、組織或細胞中mRNA轉錄本出現(xiàn)、結構和表達水平的基本方法。RT-PCR的基本步驟包括:提取樣品mRNA合成一個cDNA拷貝,接著擴增感興趣的基因。通常因兩個步驟中使用的反應緩沖液不能兼容,所以這兩個步驟(RT和PCR)分別進行。最近一種全新試劑盒,使RT-PCR可以通過一步法完成更加快

10、速有效,而在兩步法實驗中可以獲得更高的靈敏度。  3.蛋白質檢測分析技術DNA是生物信息的提供者,而蛋白質在細胞中完成了所有的工作。特定DNA序列的存在并不能保證與之相應的蛋白的合成。DNA序        列并不足以描述蛋白的結構、功能和在細胞中的位置。實際上,蛋白激活的信號途徑可以立即引起一個細胞的遷移、死亡或開始分裂,而此時可能DNA/RNA基因表達等還沒開始發(fā)生變化。因此,推動移植腎損傷的分子病理學研究技術應來自于蛋白分析的方法。3.1免疫組織化學方法(immunohistochemistry)隨

11、著免疫學的理論和技術的發(fā)展,基于免疫學的核心抗原抗體結合這一原理,免疫組織化學技術從組織細胞水平進行抗原抗體反應,使免疫學技術與病理形態(tài)學有機結合。免疫組化的優(yōu)點為:(1)特異性強:由于免疫學的基本原理是抗原與抗體的“一對一”的特異結合,因此,免疫組織化學從理論上講也是“一對一”的組織細胞中抗原的特定顯示,只是當組織細胞中存在交叉抗原時才會出現(xiàn)交叉反應。(2)敏感性高:現(xiàn)在由于ABC法或SP法的出現(xiàn),使抗體稀釋成千上萬倍仍可在組織細胞中與抗原結合,這樣高敏感性的抗體抗原反應,使免疫組織化學的方法越來越方便地用于常規(guī)診斷工作中。(3)定位準確、形態(tài)與功能相結合,可在組織和細胞中進行抗原的準確定位

12、,可以進行形態(tài)與功能相結合的研究,對病理學研究的深入十分有意義。免疫組織化學方法是病理學研究中最早引入的分子生物學技術,已經(jīng)在移植腎排斥反應的分子診斷中得到廣泛應用,為探索移植免疫病理改變和病變局部參與免疫排斥相關分子表達的研究以及在慢性移植腎病腎損傷中的分子表達的研究作出重要貢獻2,3。3.2蛋白印跡(Western blot)方法是將用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質轉移到硝酸纖維素濾膜上,在其上進行抗原抗體反應,檢測出目的成分。以此確定目的蛋白的存在與否,并可以看出表達量的差異,據(jù)此研究所關心的目的基因的表達情況。用于檢測由基因擴增所致的產物過表達,不僅能檢出蛋白質量的變化,而且能獲取更多

13、的生物學信息。  4.生物芯片技術生物芯片是近10年在生命科學領域中迅速發(fā)展起來的一項高新技術。它主要是指通過微加工和微電子技術在固體芯片表面構建微型生物化學分析系統(tǒng),以實現(xiàn)對生命機體的組織、細胞、蛋白質、核酸、糖類以及其他生物組分進行準確、快速、大信息量的檢測。目前常見的生物芯片分為三大類:即基因芯片(Gene chip,DNA chip,DNAmicroarray)、蛋白芯片(Protein chip)、芯片實驗室(Lab on a chip)等。生物芯片主要特點是高通量、微型化和自動化。生物芯片上高度集成的成千上萬密集排列的分子微陣列,能夠在很短時間內分析大量的生物分子,使人們

14、能夠快速準確地獲取樣品中的生物信息,檢測效率是傳統(tǒng)檢測手段的成百上千倍5。生物芯片技術將改變生命科學的研究方式,革新醫(yī)學診斷和治療,極大地提高人口素質和健康水平。生物芯片在疾病檢測診斷方面具有獨特的優(yōu)勢,它可以在一張芯片上同時對多個病人進行多種疾病的檢測。僅用極小量的樣品,在極短時間內,向醫(yī)務人員提供大量的疾病診斷信息,這些信息有助于醫(yī)生在短時間內找到正確的治療措施。生物芯片技術的深入研究和廣泛應用,將對移植免疫的分子病理研究產生極其深遠的影響1,6。采用高通量生物芯片技術可以充分反映移植組織遭受急性排斥反應攻擊時的基因表達以及蛋白質的差異表達。對急性排斥反應時細胞毒性T細胞效應分子如:INF

15、刺激生長因子-3(interferon-stimulated growth factor-3)、補體因子3、煙堿-甲基轉移酶(nicotinamide N-methyltransferase)、巨噬細胞趨化蛋白3、以及骨髓由來的不同蛋白、CD18等多種因子基因表達進行檢測。因為這種方法不僅局限于原有的已知的幾個與AR有關的基因,很可能在排斥反應發(fā)生機制和診斷方面,提高對參與排斥反應基因表達和更多生物學信息的研究,籍此發(fā)現(xiàn)新的生物學標志物7,為今后早期診斷排斥反應和制定治療方案提供幫助。  5.激光捕獲顯微分離技術(Laser capture microdissection-LCM)在進行移植腎損傷的分子病理學研究中,解決不同組織干擾問題需要新技術的支持,顯微分離技術可以來協(xié)助克服這一問題。由于激光捕獲顯微分離技術(Laser capture micro-dissection, LCM)可