血管平滑肌細胞的增殖及西洋參葉二醇組皂苷的干預作用(一)

1、血管平滑肌細胞的增殖及西洋參葉二醇組皂苷的干預作用(一)    作者：邵偉 袁曉波王智昊 趙學忠【摘要】 目的 觀察西洋參葉二醇組皂苷（PQDS）對增殖的血管平滑肌細胞（VSMC）的干預作用，探討PQDS干預VSMC的增殖作用及機制。方法 組織貼塊法培養(yǎng)大鼠胸主動脈VSMC，用AngII誘導VSMC增殖。隨機分為：空白對照組、Ang模型組、Ang+PQDS 100、50、25 mg/L不同劑量組。用MTT法、流式細胞術(shù)觀察PQDS對細胞增殖、細胞周期、增殖指數(shù)的影響。結(jié)果 PQDS可減低VSMC的增殖能力，將增殖的VSMC抑制在G0/G1期。結(jié)論 PQD

2、S能抑制VSMC增殖，其機制可能與將增殖的VSMC抑制在G0/G1期有關。 【關鍵詞】 西洋參葉二醇組皂苷；血管平滑肌細胞；血管緊張素II冠狀動脈粥樣硬化（AS）的主要病理變化是血管平滑肌細胞（VSMC）的增殖1,2。誘導VSMC增殖因素有很多，其中較重要的因素為血管緊張素（Ang）。Ang是腎素血管緊張素系統(tǒng)（RAS）中重要的生物活性肽，經(jīng)過一系列細胞信號轉(zhuǎn)導可誘導細胞增殖3。西洋參葉二醇組皂苷（PQDS）是五加科人參屬植物，有抗心肌缺血、縮小心肌梗死面積的作用4。目前尚未有文獻報道PQDS對VSMC增殖的影響，本文就PQDS對VSMC增殖的干預作用進行研究。1 材料與方法1.1 試劑及材料

3、Wistar大鼠3只，雄性，120150 g。PQDS粉末、Ang（Sigma公司），胎牛血清FBS、RPMI1640培養(yǎng)基、Trizol（Gibco公司），兔抗大鼠平滑肌肌動蛋白（SMA）（美國Lab vision公司），SP抗兔試劑盒、DAB顯色試劑盒（中杉金橋生物工程有限公司），MTT、碘化丙錠、RNA酶（Sigma分裝）。1.2 VSMC的培養(yǎng)及鑒定用組織貼塊法進行中層VSMC培養(yǎng)，當細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%以上時，傳代培養(yǎng)，取第36代培養(yǎng)物，經(jīng)兔抗大鼠SMA免疫組化染色鑒定，陽性細胞98%，證實培養(yǎng)的是VSMC，實驗用510代VSMC。1.3 分組將細胞隨機分為5組，空白對照組：正常V

4、SMC組；Ang模型組：Ang 10-7 mol/L，PQDS高劑量組（PQDS1）：PQDS 100 mg/L+ Ang 10-7 mol/L； PQDS中劑量組（PQDS2）：PQDS 50 mg/L+ Ang 10-7 mol/L；PQDS低劑量組（PQDS3）：PQDS 25 mg/L+ Ang 10-7 mol/L；以上各組細胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，于5%CO2、37、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1.4 MTT法檢測細胞增殖能力用0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成單細胞懸液，以每孔103104個細胞接種于96孔培養(yǎng)板

5、中，每孔體積為200 l。將培養(yǎng)板放入CO2孵箱中37、5% CO2及飽和濕度條件下，培養(yǎng)24 h，待培養(yǎng)細胞貼壁后，吸去培養(yǎng)液。按照上述分組中的給藥，各組細胞在10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，于CO2孵箱中37、5%CO2及飽和濕度條件下，培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液20 l，37繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，吸棄培養(yǎng)上清液，每孔加150 l二甲基亞楓（DMSO），振蕩10 min。然后選擇490 nm波長，在酶標儀上測定各孔吸光度值，記錄結(jié)果。1.5 流式細胞儀檢測細胞周期及增殖指數(shù)將細胞接種在培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h，后換無血清RPMI1640培養(yǎng)液作用24 h,使細胞

6、同步化于G0期。按前述分組方案加藥處理后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后收集細胞，離心1 000 r/min×5 min，棄上清。用4預冷的70%冷乙醇固定18 h，之后調(diào)整細胞濃度為1×106細胞/ml，PI染色37孵育30 min后進行流式分析，應用ModFit LT3.0軟件分析細胞周期中各期細胞所占總細胞的百分率；計算細胞增殖指數(shù)（PI），PI=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）。1.6 統(tǒng)計學處理采用SPSS軟件進行統(tǒng)計處理，所有計量數(shù)據(jù)以x±s表示，采用單因素方差分析（ANOVA）、SNK檢驗進行差異的統(tǒng)計學處理。2 結(jié) 果2.1 VSMC的鑒定用

7、倒置相差顯微鏡和SMA免疫組化染色，對VSMC進行鑒定。細胞培養(yǎng)35 d后，用相差顯微鏡觀察可見少量細胞自組織塊邊緣游離出來，細胞呈梭形或長梭形排列，然后細胞呈放射性生長，長軸與組織塊邊緣垂直，多為兩極，胞漿均勻，可見圓形細胞核及分裂相。至培養(yǎng)10 d左右出現(xiàn)局部成束的細胞平行排列，部分區(qū)域細胞重疊，部分區(qū)域高低起伏呈“峰、谷”狀生長。SMA染色發(fā)現(xiàn)>98%的細胞染色呈陽性，即細胞漿內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色反應，胞核不著色，表明細胞含有SMA，證明培養(yǎng)的細胞為VSMC。見圖1。2.2 PQDS對VSMC增殖能力的干預Ang模型組OD值(0.862 5±0.06)比空白對照組(0.791 3

8、±0.04)明顯升高（P0.05），提示Ang可促進VSMC的增殖，造模成功。PQDS高、中劑量組OD值(0.773 8±0.05，0.807 5±0.03)比Ang模型組均顯著降低（P0.05），PQDS低劑量組(0.812 5±0.06)有下降趨勢，但是沒有統(tǒng)計學意義（P>0.05），提示PQDS能夠抑制VSMC增殖。2.3 PQDS 對VSMC的細胞周期及PI的干預Ang模型組較空白對照組G0/G1期VSMC百分率明顯減少（P0.05），S期、G2/M期VSMC百分率顯著增加（P0.05），增殖指數(shù)明顯升高（P0.05）。提示Ang可以促進V

9、SMC從G1/G0期向S期轉(zhuǎn)化，誘導VSMC增殖，造模成功。PQDS藥物組較Ang模型組G0/G1期的VSMC百分率均顯著增加（P0.05）；S期的VSMC百分率、增殖指數(shù)均顯著減少（P0.05）；PQDS高、中劑量組G2/M期VSMC百分率顯著降低（P0.05），低劑量組G2/M期百分率降低，但沒有明顯差異（P>0.05）。上述結(jié)果顯示PQDS干預Ang誘導的VSMC增殖，主要將細胞抑制在G1/G0期，見表1。表1 PQDS對細胞周期及增殖指數(shù)的影響(略)3 討 論目前臨床上抑制VSMC增殖的藥物有鈣離子拮抗劑、受體阻斷劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、免疫抑制劑雷帕霉素、降脂藥普羅布考等5

10、，但抑制VSMC增殖的中藥開發(fā)得較少。中藥是祖國醫(yī)藥的神奇寶藏，在中醫(yī)整體理論的指導下，可發(fā)揮多靶點、多成分協(xié)同作用的優(yōu)勢，療效顯著、價格低廉、毒副作用小。因此，開發(fā)抑制VSMC增殖的安全有效的中藥及探討抑制VSMC增殖的機制有重要意義。Ang是腎素血管緊張素系統(tǒng)中最重要的生物活性肽，不僅是血管活性物質(zhì)引起機體血流動力學改變，而且通過自分泌、旁分泌刺激VSMC增殖6。本實驗用Ang誘導VSMC增殖，MTT法觀察到Ang模型組OD值比空白對照組明顯增高，說明Ang促進VSMC增殖，表明實驗造模成功。本文通過流式細胞儀技術(shù)，發(fā)現(xiàn)Ang 使G0/G1期的VSMC百分率明顯減少，S期、G2/M期的VS

11、MC百分率明顯增加。證實Ang促使VSMC從G0/G1期進入到S期、G2/M期，誘導細胞增殖。西洋參莖葉皂苷（PQS）系五加科人參屬植物，包括PQDS和三醇組皂苷等。研究證明PQDS可增加急性心肌梗死犬心肌血流量，降低冠脈阻力，明顯降低心肌耗氧量、心肌氧攝取率及心肌耗氧指數(shù)7，可增加小鼠心肌 Rb攝取率，增加心肌營養(yǎng)性血流量8，可明顯縮小心肌梗死面積，減少血清中肌酸磷酸激酶（CPK）及乳酸脫氫酶（LDH） 活性9 。本實驗證明PQDS對VSMC增殖有抑制作用。PQDS組OD值明顯比Ang組減低，說明PQDS可抑制細胞增殖。PQDS各組可增加G0/G1期VSMC的百分率，減少S期、G2/M期VS

12、MC的百分率，減少增殖指數(shù)，阻斷細胞由G0/G1期向DNA合成的S期、G2/M期轉(zhuǎn)化。說明PQDS可抑制VSMC的增殖，可將VSMC細胞抑制在G0/G1期，進而證明PQDS通過抑制VSMC增殖而起到對AS的防治作用?！緟⒖嘉墨I】1 Campbell JH, Campbell GR. Culture techniques and their applications to studies of vascular smooth muscleJ. Clin Sci, 1993；85:50113.2 Locher R, Emmanuele L, Paolo M，et al.Green tea poly

13、phenols inhibit human vascular smooth muscle cell proliferation stimulated by native lowdensity lipoproteinJ.Eur J Pharmacol, 2002；(434)：17.3 Owens GK.Regulation of differentiation of vascular smooth muscleJ. Physiol Rev,1995；75(7):487517.4 Mallat Z, Gojova A, MarchiolFournigault C，et al. Inhibition of transforming growth factor signaling accelerates atherosclerosis and induces an unstable plaque phenotype in miceJ. Circ Res