培養(yǎng)基及設備的滅菌

1、第五章培養(yǎng)基及設備的滅菌 第一節(jié) 培養(yǎng)基滅菌的目的、要求和方法一、定義1,培養(yǎng)基滅菌的定義是指從培養(yǎng)基中殺滅有生活水平的細菌營養(yǎng)體及其抱子,或從中將其除去.工業(yè)規(guī)模的液體培養(yǎng)基滅菌,殺滅雜菌比除去雜菌更為常用.2,滅菌與消毒的區(qū)別滅菌:用物理或化學方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物,包括營養(yǎng)細胞、細菌芽抱和抱子消毒:用物理或化學方法殺死物料、容器、器皿內(nèi)外的病源微生物.二、培養(yǎng)基滅菌的目的1,在發(fā)酵過程中夾雜其它雜菌造成的后果：生產(chǎn)菌和雜菌同時生長,生產(chǎn)菌喪失生產(chǎn)水平；在連續(xù)發(fā)酵過程中,雜菌的生長速度有時會比生產(chǎn)菌生長得更快,結果使發(fā)酵罐中以雜菌為主；雜菌及其產(chǎn)生的物質(zhì),使提取精制發(fā)生困難雜菌會降

2、解目的產(chǎn)物；雜菌會污染最終產(chǎn)品,雜菌會污染最終產(chǎn)品；發(fā)酵時如污染噬菌體,可使生產(chǎn)菌發(fā)生溶菌現(xiàn)象.2,工業(yè)上具體舉措包括：(1)使用的培養(yǎng)基和設備須經(jīng)滅菌；(2)好氧培養(yǎng)中使用的空氣應經(jīng)除菌處理；(3)設備應嚴密,發(fā)酵罐維持正壓環(huán)境；(4) 培養(yǎng)過程中參加的物料應經(jīng)過滅菌；(5)使用無污染的純粹種子.3,培養(yǎng)基滅菌的目的殺滅培養(yǎng)基中的微生物,為后續(xù)發(fā)酵過程創(chuàng)造無菌的條件.4,培養(yǎng)基滅菌的要求(1)到達要求的無菌程度(10-3)(2)盡量減少營養(yǎng)成分的破壞,在滅菌過程中,培養(yǎng)基組分的破壞,是由兩個根本類型的反響引起的：培養(yǎng)基中不同營養(yǎng)成分間的相互作用；對熱不穩(wěn)定的組分如氨基酸和維生素等的分解.5,

3、滅菌的方法(1)化學法化學藥品滅菌法(2)物理法干熱滅菌法濕熱滅菌法射線滅菌法6,濕熱滅菌的原理每一種微生物都有一定的最適生長溫度范圍.當微生物處于最低溫度以下時,代謝作用幾乎停止而處于休眠狀態(tài).當溫度超過最高限度時,微生物細胞中的原生質(zhì)膠體和酶起了不 可逆的凝固變性,使微生物在很短時間內(nèi)死亡, 加熱滅菌即是根據(jù)微生物這一特性而進行的.7,濕熱滅菌中的相關定義?殺死微生物的極限溫度稱為 致死溫度.在致死溫度下,殺死全部微生物所需的時間稱為致死時間；在致死溫度以上,溫度愈高,致死時間愈短.?微生物的熱阻：是指微生物在某一特定條件 (主要是溫度和加熱方式) 下的致死時間.相對熱阻是指某一微生物在某

4、條件下的致死時間與另一微生物在相同條件下的致死 時間的比值.各種微生物對濕熱的相對熱阻微生物 相對熱阻營養(yǎng)細胞和酵母1.0細菌芽抱3 M06霉菌抱子210病毒和噬菌體158,濕熱滅菌的優(yōu)點?蒸汽來源容易,操作費用低,本身無毒；?蒸汽有強的穿透力,滅菌易于徹底；?蒸汽有很大的潛熱；?操作方便,易治理.第二節(jié)濕熱滅菌的理論根底一,培養(yǎng)基濕熱滅菌需解決的工程問題1,將培養(yǎng)基中的雜菌總數(shù) N0殺滅到可以接受的總數(shù) N (10-3),需要多高的溫度、多 長的時間為合理.2,菌溫度和時間確實定取決于：(1)雜菌抱子的熱滅死動力學(2)反響器的形式和操作方式(3)培養(yǎng)基中有效成分受熱破壞的可接受范圍二、微生

5、物的熱死滅動力學方程實驗證實,微生物營養(yǎng)細胞的均相熱死滅動力學符合化學反響的一級反響動力學,即:dN"dTN:任一時刻的活細菌濃度個 /L t:時間minK:比熱死速率常數(shù)min-1取邊界條件t0=0, N=N q,對1積分得N Nq e Kt3fflaj營養(yǎng)細胞典型死亡速率的數(shù)據(jù) < 大腸桿窗>實驗還證實,細菌抱子的熱殺滅動力學與營養(yǎng)細胞的有所不同.它表現(xiàn)為非對數(shù)的死亡動力學.這可能與抱子壁的化學成分及結構有關.但當溫度超過120?C時,熱阻極強的嗜熱脂肪芽抱桿菌抱子的熱殺滅動力學也接近對數(shù)死亡動力學即符合一級反響規(guī)律.三、溫度對K的影響微生物的熱死滅動力學接近一級反響

6、動力學,它的比熱死滅速率常數(shù)K與滅菌溫度 T的關系可用阿累尼烏斯方程表征E/RTK A e4A :頻率因子min-1AE:活化能J/molR:通用氣體常數(shù)J/ mol.k從方程4可以看出：1活化能AE的大小對K值有重大影響.其它條件相同時,AE越高,K越低,熱死速率越慢.2不同菌的抱子的熱死滅反響A E可能各不相同.對方程4兩邊取對數(shù),得方程5ln K RE ln A 5K是AE和T的函數(shù),K的對T的變化率與有關,對方程5兩邊對T取導數(shù),得方 程6.由方程6可得出結論：反響的 AE越高,lnK對T的變化率越大,即 T的變化 對K的影響越大試驗說明, 細菌抱子熱死滅反響的 A E很高,而某些有效

7、成分熱破壞反響的AE較低見下表.將溫度提升到一定程度,會加速細菌抱子的死滅速度,縮短滅菌時間, 由于有效成分的 AE很低,溫度的提升只能稍微增大其破壞速度,但由于滅菌時間的顯著縮 短,有效成分的破壞反而減少.受熱物質(zhì)A E (J/mol)維生素B1296232維生素B1鹽酸鹽92048嗜熱脂肪芽抱桿菌抱子283257肉毒梭菌抱子343088317984X 4.184匕Kbs從 0.12 (AEbs =67000 X 4.184 (J/mol),維生素 105?CK高127?C,Kvb* 0：02(mirT1)；Min-1). 3DBi 的 AEvb=22000 是高到 0.06(min-1),

8、枯草桿菌抱子嗜熱脂肪芽抱桿菌抱子和維生素Bi的lnK-1/T圖嗜熱脂肪芽抱桿菌抱子死滅程度為N/No=1O-16時,滅菌溫度對維生素B1破壞的影響火菌溫度C到達滅菌程度的時間min維生素B1的損失%10084399.9911075891207.6271300.851101400.10731500.0151第三節(jié)培養(yǎng)基滅菌的工程設計一、無菌的標準根據(jù)微生物熱死滅方程, 要求滅菌后到達絕對無菌是很難做到的,也是不必要的.因此在工程設計中常取 N=10-3.二、分批滅菌1,分批滅菌的設計在發(fā)酵罐中進行實罐滅菌,是典型的分批滅菌.全過程包括升溫、保溫、降溫三栩用:一0 L,. 上 -工 一 1.1_

9、、一 一 口 20 40 6030 100 120 140 160 18.205 220 24.263Bifl 分dNdT池子熱死亡的規(guī)律符合積分得(8)ln NN0 Kt8在分批滅菌過程中l(wèi)n學東：格 得喏ln中0 1n左ln等 9N1共Kht2 ti111n N2 A t3e E/RTdt 12K不是常數(shù),所以:t2由于升溫、冷卻階段 T是時間t的函數(shù), 式中Kh是保溫階段的抱子比熱死亡速度常數(shù)分批滅菌中幾種換熱方式的溫度-時間變化關系加熱或者冷 卻的型式溫度-時間變化關系直接蒸汽鼓泡T = Tot 1斗(1芋41間接加熱T=Th(1電加熱 T = Tq( J + cu )盤管冷卻Tcc

10、C 1 + p'at )hs又 Sa = MCpTo§ = MUA a To- Th產(chǎn),0 = " Th口_s 一 及P*WCp -tiA/wc'pT：介質(zhì)溫度(K); T.：介質(zhì)初溫(K); t:時間(min); h：蒸汽相對于介質(zhì)的熱 始(kJ/kg); s：蒸汽的重量流率(kg/min ); M ：介質(zhì)重量(kg); Cp：介質(zhì)比熱kJ/(kg.K);Th：熱源溫度(K); U :總傳熱系數(shù)kJ/ (m2.min.K) ; q：傳熱速率(kJ/min); Cp： 冷卻劑比熱；W:冷卻劑流率；Tco：冷卻劑溫度2,計算舉例(自學)參見：?微生物工程工藝原

11、理?P226、倫世儀主編?生化工程?P13.3,保證間歇滅菌 成功的要素(1)內(nèi)部結構合理(主要是無死角),焊縫及軸封裝置可靠,蛇管無穿孔現(xiàn)象(2)壓力穩(wěn)定的蒸汽發(fā)酵罐的接管圖4,培養(yǎng)基間歇滅菌過程中應注意的問題(1)溫度和壓力的關系(2)泡沫問題(3)投料過程中,妹皮和豆餅粉等固形物在罐壁上殘留的問題(4)滅菌結束后應立即引入無菌空氣保壓、連續(xù)滅菌的設計 1 ,連續(xù)滅菌的流程(1)噴射加熱連續(xù)滅菌狙有時間典型的噴射加熱連續(xù)滅菌時的溫度和時間曲線圖(2)薄板換熱器連續(xù)滅菌薄板換熱器連續(xù)滅菌流程薄板換熱器連續(xù)滅菌時的溫度和時間曲線圖(3)噴淋冷卻連續(xù)滅菌7連酒塔連儂3放汽培養(yǎng)液 冷卻水幢淋冷用器

12、噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程2,連續(xù)滅菌設計及計算舉例(自學)參見：?微生物工程工藝原理? P228,倫世儀主編?生化工程?P22.3,連續(xù)滅菌設備的結構及計算(1)設備結構: 套管式連消塔口噴嘴式連消塔連消器噴射加熱器圖2-19噴射加熱器示意圖1 一嗜臂2一吸入口 3吸入室,一混合嗔膏5-混合段6一擴大管薄板換熱器維持罐(2)連消塔計算(自學)參見?發(fā)酵工程與設備? P53四、連續(xù)滅菌與間歇滅菌的比較 1,連續(xù)滅菌的優(yōu)缺點優(yōu)點- 保存較多的營養(yǎng)質(zhì)量- 容易放大- 較易自動限制；- 糖受蒸汽的影響較少；- 縮短滅菌周期；- 在某些情況下,可使發(fā)酵罐的腐蝕減少；- 發(fā)酵罐利用率高；- 蒸汽負荷均勻.缺點

13、- 設備比較復雜,投資較大.2,分批滅菌的優(yōu)缺點優(yōu)點- 設備投資較少- 染菌的危險性較小- 人工操作較方便- 對培養(yǎng)基中固體物質(zhì)含量較多時更為適宜缺點-滅菌過程中蒸汽用量變化大, 造成鍋爐負荷波動大,一般只限于中小型發(fā)酵裝置.五、影響滅菌的因素 (1)培養(yǎng)基成分對滅菌的影響油脂,糖類及一定濃度的蛋白質(zhì)可增加微生物的耐熱性,另一些物質(zhì),如高濃度的鹽類,色素等可削弱其耐熱性.- 2)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)對滅菌的影響- 3)培養(yǎng)基中微生物數(shù)量對滅菌的影響- 4)培養(yǎng)基中氫離子濃度對滅菌的影響培養(yǎng)基中氫離子濃度直接影響滅菌的效果.培養(yǎng)基的酸堿度越大,所需殺滅微生物的溫度越低.(5)微生物細胞中水分對滅菌的影響細胞含水越多,蛋白質(zhì)變性的溫度越底- 6)微生物細胞菌齡對滅菌的影響老細胞水分含量低、低齡細胞水分含量高- 7)空氣排除情況對滅菌的影響- 8)攪拌對滅菌的影響- 9)泡沫對滅菌的影響六、發(fā)酵罐的滅菌培養(yǎng)基的滅菌如果是采用連續(xù)滅菌法.那么發(fā)酵罐應在參加滅菌的培養(yǎng)基前先行單獨滅菌.通常是用蒸汽加熱發(fā)酵罐的夾套或設管并從空氣分布管中通入蒸汽,充滿整個容器后,再從徘氣管中緩緩排出.容器內(nèi)的蒸汽壓力保持1公斤