轉(zhuǎn)基因工程復(fù)習題與答案

1、基因工程原理復(fù)習題思考題1、基因工程的定義與特征。2、試述基因工程的主要研究內(nèi)容。3、基因工程在食品工業(yè)上有何應(yīng)用發(fā)展？4、轉(zhuǎn)基因是一把雙刃劍，請客觀談?wù)剬D(zhuǎn)基因及轉(zhuǎn)基因食品安全性的認識。1、原核生物和真核生物的基因表達調(diào)控有何差別？2、什么是基因？根據(jù)基因的產(chǎn)物，基因可分為哪三類？3、引起核酸變性的因素主要有哪些？核酸變性后性質(zhì)有何變化？4、DNA 復(fù)性及其影響因素。1，DNA 凝膠電泳中核酸分子分離的機理。2，DNA 凝膠電泳中影響電泳遷移率的因素主要有哪些？3，PCR 的原理和主要反應(yīng)過程，并分析影響 PCR 擴增的影響因素。4，PCR 引物設(shè)計的原則，若給一指定 DNA 序列并需要通過

2、 PCR 擴增此序列， 如何設(shè)計擴增引物？5, 定量PCR的原理？ Ct值的含義。6，分子雜交的類型主要有哪些？探針的標記方法與標記類型？常用的雙鏈DNA 的標記方法是哪兩種？7, Southern雜交一般過程及影響雜交因素。8, 基因組文庫的構(gòu)建過程？如何確定文庫的大??？9, 基因文庫的類型包括哪兩種？各有什么特點？10, 一般質(zhì)粒 DNA 的構(gòu)型有哪幾種？在瓊脂糖凝膠電泳中的有何特點？11, 堿裂解法提取質(zhì)粒 DNA 的原理,分析影響試驗結(jié)果的各種可能因素。12, 電泳緩沖液使用一定時間后出現(xiàn) DNA 在凝膠中跑不動現(xiàn)象的原因,有 何解決辦法？13, 電泳的指示劑和染色劑有何區(qū)別,各自的作

3、用是什么？1 限制性核酸內(nèi)切酶的類型,基因工程常用的是哪種限制性核酸內(nèi)切酶？2 什么是星活性,產(chǎn)生星活性的因素可能有哪些？ 3結(jié)合已做的實驗,分析影響酶切的因素。4 限制性核酸內(nèi)切酶命名規(guī)則及各字母代表的含義。5 簡單敘述同尾酶和同裂酶的差別。6連接酶主要有哪些類型？有何異同點？影響連接酶連接效果的因素主要有哪些？7 試分析提高平端 DNA 連接效率的可能方法。8 基因工程中常用的 DNA 聚合酶主要有哪些？1、作為基因工程載體,其應(yīng)具備哪些條件？2、質(zhì)粒的不相容性及其分子機理。3、載體的類型主要有哪些？在基因工程操作中如何選擇載體？4、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原理,影響轉(zhuǎn)化率的因素有哪些？5 重組體分子的選

4、擇方法主要有哪些？并簡單闡述其原理1、基因的克隆方法主要有哪些？并闡述其克隆原理 （至少 3種,都是書上找的, 自選哈，建議必選DD RT-PCR和SSH,原因請看下題）2、簡單闡述差異顯示 PCR 克隆基因的原理及其優(yōu)缺點,有何應(yīng)用？ 3抑制性差減雜交的原理與應(yīng)用。4 酵母雙雜交技術(shù)、噬菌體表面展示技術(shù)的原理。5、T-DNA 標簽法克隆基因的一般技術(shù)路線。1、通過比較，分析大腸桿菌表達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng)各有何優(yōu)缺點。2、如何提高克隆基因的表達水平？3、克隆基因目的蛋白的表達的形式主要有哪些類型？4、啟動子從轉(zhuǎn)錄模式上可分為哪兩種？表達系統(tǒng)常選用哪一種？其機理是什 么？5、表達載體和基因工程一

5、般克隆載體在元件構(gòu)成上有何差別？6、根據(jù)表達蛋白用途的不同，設(shè)計選擇基因的表達策略。1、什么叫轉(zhuǎn)基因植物？植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基本路線主要包括哪些？2、外源基因?qū)胫参锏姆椒ㄖ饕心男?、運用已學(xué)的知識，如何全面分析獲得的轉(zhuǎn)基因個體（提示：包括外源基因是 否整合，被插入位點分析，外源基因是否表達，表達量如何？等）4、出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象的可能原因分析?；蚬こ叹w論1、基因工程的定義與特征。定義： 在體外把核酸分子 （DNA 的分離、 合成） 插入載體分子， 構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合 （重 組 DNA ），引入原先沒有這類分子的受體細胞內(nèi)， 穩(wěn)定地復(fù)制表達繁殖， 培育符合人們需要 的新品種（品系） ，生

6、產(chǎn)人類急需的藥品、食品、工業(yè)品等。特征： 1、具跨越天然物種屏障的能力。2、強調(diào)了確定的 DNA 片段在新寄主細胞中的擴增。2、試述基因工程的主要研究內(nèi)容。1）、目的基因的分離2）、 DNA 的體外重組（載體、受體系統(tǒng)等）3）、重組 DNA 分子轉(zhuǎn)移到受體細胞及其篩選4）、基因在受體細胞內(nèi)的擴增、表達、檢測及其分析。3、基因工程在食品工業(yè)上有何應(yīng)用發(fā)展？主要是通過基因重組， 使各種轉(zhuǎn)基因生物提高生產(chǎn)谷氨酸、 調(diào)味劑、 酒類和油類等有機物的 產(chǎn)率；或者改良這些有機物組成成分，提高利用價值。4、轉(zhuǎn)基因是一把雙刃劍，請客觀談?wù)剬D(zhuǎn)基因及轉(zhuǎn)基因食品安全性的認識。 轉(zhuǎn)基因技術(shù)所帶來的好處是顯而易見的，在

7、人類歷史進步和發(fā)展中起到了積極作用。 首先，通過該項技術(shù)可以提供人們所需要的特性，改良培育新品種； 第二，延長食品保存時間或增加營養(yǎng)成分； 第三，將抗蟲防菌基因轉(zhuǎn)入到作物中，使作物本身產(chǎn)生抵抗病蟲害侵襲的能力， 減少了農(nóng)藥的使用量，有利于環(huán)境保護； 第四，轉(zhuǎn)基因技術(shù)及基因食物在醫(yī)學(xué)方面得到廣泛研究和應(yīng)用。人們對轉(zhuǎn)基因技術(shù)的主要擔憂在于環(huán)境方面。外源基因的導(dǎo)入可能會造就某種強勢生 物， 產(chǎn)生新物種或超級雜草、損害非目標生物、破壞原有生物種群的動態(tài)平衡和生物多樣 性，也即轉(zhuǎn)基因生物存在潛在的環(huán)境安全問題。轉(zhuǎn)基因作物的大面積種植已有數(shù)年， 食用轉(zhuǎn)基因食品的人群至少有 10億之多，但至今 仍未有轉(zhuǎn)基因

8、食品對生命造成危害的實例； 更何況目前每一種基因工程食品在上市前， 都要 經(jīng)過國家法律認可， 食品衛(wèi)生部門和環(huán)境部門的嚴格檢測。只有測試合格了，才能投放市 場。因此公眾完全可以安全地消費、大膽地食用轉(zhuǎn)基因食品。第一章 DNA 的分子特性與利用5、原核生物和真核生物的基因表達調(diào)控有何差別？1）原核基因表達調(diào)控的三個水平：轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、翻譯水平調(diào)控、蛋白質(zhì)加工水平的調(diào)控 原核基因表達調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控。2）真核生物基因表達的特點：1基因組 DNA 存在的形式與原核生物不同；2真核生物中轉(zhuǎn)錄和翻譯分開進行；3基因表達具有細胞特異性或組織特異性；4真核基因表達的調(diào)控在多個水平上進行：DNA

9、水平的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控、翻譯水平調(diào)控、蛋白質(zhì)加工水平的調(diào)控；6、什么是基因？根據(jù)基因的產(chǎn)物，基因可分為哪三類？ 基因是具有生物學(xué)功能的、 在染色體上占據(jù)一定位置的一段核苷酸序列， 是分子遺傳的功能 單位。根據(jù)基因的產(chǎn)物，基因可分為三類：轉(zhuǎn)錄并翻譯編碼蛋白質(zhì)的基因 :包括結(jié)構(gòu)蛋白基因、編碼酶的基因、調(diào)節(jié)基因 轉(zhuǎn)錄但不翻譯產(chǎn)物的基因 :包括 tRNA 、rRNA 不轉(zhuǎn)錄但有功能的 DNA 區(qū)段 :如啟動子、操縱基因7、引起核酸變性的因素主要有哪些？核酸變性后性質(zhì)有何變化？ 引起核酸變性的因素： -溫度、酸、堿、甲醛和尿素等。DNA變性后，它的一系列性質(zhì)發(fā)生變化，如紫外吸收（260

10、 nm）值升高（增色效應(yīng)），粘度降低等，如 DNA 增加 2540%. RNA 約增加 1.1%。8、DNA 復(fù)性及其影響因素。變性 DNA 在適當?shù)臈l件下，兩條彼此分開的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程 稱為復(fù)性。DNA 復(fù)性的程度、速率與復(fù)性過程的條件有關(guān)，也與它本身的組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)：分子量越 大復(fù)性越難。濃度越大，復(fù)性越容易。（附加： 注意：將熱變性的 DNA 驟然冷卻至低溫時， DNA 不可能復(fù)性。 但是將變性的 DNA 緩慢冷卻時，可以復(fù)性。復(fù)性的應(yīng)用：核酸的雜交，分子擴增）第二章 基因工程操作的基本技術(shù)1. DNA 凝膠電泳中核酸分子分離的機理。在堿性環(huán)境下， 核酸分子帶負

11、電荷， 在外加電場的作用下， 分子在凝膠多孔性剛性濾孔 中從負極向正極泳動， 其中主要由于分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)達到分離不同大小核酸分子的目 的。2. DNA 凝膠電泳中影響電泳遷移率的因素主要有哪些？1）分子本身的影響分子的大?。盒t快 帶電荷數(shù)：多則快 分子構(gòu)型：超螺旋 解螺旋2）電場：直流電場電壓高則快 電壓太高則結(jié)果不準確 常用 35V/CM3）支持物介質(zhì)種類：瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠 凝膠濃度 : 濃度大，篩孔小，適合小分子電泳；濃度小，篩孔大，適合大分子電泳4）電泳緩沖液pH 值：偏堿性，帶負電荷 離子濃度：離子濃度高 電流大 發(fā)熱快 膠溶解 種類： TAE、TBE 、TPE、TN

12、E3. PCR 的原理和主要反應(yīng)過程，并分析影響 PCR 擴增的影響因素。PCR 原理：變性溫度下， DNA 雙鏈變性雙螺旋解開成單鏈 DNA ，在退火溫度中人工合成 的特異引物根據(jù)堿基互補配對原則與單鏈 DNA 特異結(jié)合，然后在 DNA 聚合酶的作用下， 在延伸溫度下不同的脫氧核苷酸按照堿基互補配對原則在引物的引導(dǎo)下合成與模板DNA 互補的新鏈，實現(xiàn) DNA的擴增。 影響PCR擴增的影響因素：§Taq酶：常用1U/25此濃度低，擴增產(chǎn)物不夠；濃度高，非特異性擴增增加；酶的活性；§ (2)dNTP的濃度：常用100-200 gol/L，不能低于20 mol/L ,特異性、保

13、真性；§ (3)模板：主要考慮純度及使用量，對純度要求不高，但含有酚、氯仿等雜質(zhì)則難以成功。 使用量從幾個ng到100ng.§引物濃度：0.1-0.5 mol/L之間，過多則非特異擴增增加，形成引物二聚體；§ (5)Mg2+ 濃度：常用 0.5-2.5mmol/L ；影響：酶的活性、引物-模板退火、特異性§ (6)PCR反應(yīng)程序設(shè)定：變性溫度和時間、引物退火溫度 Tm與時間、引物延伸溫度與時 間和循環(huán)數(shù)4. PCR引物設(shè)計的原則，若給一指定DNA序列并需要通過 PCR擴增此序列，如何設(shè)計擴增引物？引物設(shè)計原則：1、G+C 含量 45-55% ；2、Tm值

14、高于55 ；3、引物特異性；4、引物擴增跨度；5、是否形成引物二聚體5. 定量PCR的原理？ Ct值的含義。原理：通過實時檢測 PCR每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物相對應(yīng)的熒光信號，來實現(xiàn)對起始模板進行 定量及定性的分析。初始模板量X0的對數(shù)值與C(T)值之間呈線性關(guān)系：log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log NCt值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號開始由本底進入指數(shù)增長階段時到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(如后圖所示，圖僅供參考)DNA的標記6. 分子雜交的類型主要有哪些？探針的標記方法與標記類型？常用的雙鏈 方法是哪兩種？王要來型：探針被檢測對象Southern 雜交：DNA -DN

15、ANorthern 朵交：DNA RNAWestern 雜交：抗體蛋白質(zhì)菌落原位雜交：DNADNA探針的標記方法：切口平移法、隨機引物合成法，末端標記法，PCR標記法，體外轉(zhuǎn)錄標記法。探針按核酸分子分：DNA探針和RNA探針；按標記物的不同：放射性標記探針和非放射性標記探針。標記類型：按核酸分子的不同：可分為 DNA探針和RNA探針根據(jù)標記物的不同：可分放射性標記探針和非放射性標記探針；雙鏈DNA探針標記主要方法：切口平移法、隨機引物合成法；7. Southern雜交一般過程及影響雜交因素。Southern雜交操作步驟：（1）用限制性內(nèi)切酶酶切 DNA,經(jīng)凝膠電泳分離各酶切片段；（2）轉(zhuǎn)膜：將

16、DNA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上；（3）預(yù)雜交：封阻濾膜上非特異性位點；（4）雜交：讓探針與同源 DNA片段特異性結(jié)合；（5）洗脫：去除非特異性結(jié)合的探針；（6）自顯影檢查目的 DNA所在的位置。Southern雜交影響因子1）、目的DNA在總DNA中所占的比例2）、探針的大小和標記效率3）、轉(zhuǎn)移到濾膜上的 DNA量4）、探針與靶DNA的同源性8. 基因組文庫的構(gòu)建過程？如何確定文庫的大小？基因組文庫的構(gòu)建過程：1）從生物體提取大片斷的基因組 DNA ；2）用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶（常為4堿基識別位點）進行部分酶切或超聲波打斷基因組 DNA ；3）在瓊脂凝膠電泳上或蔗糖梯度離心篩選適當長度

17、的 DNA片斷（根據(jù)載體的要求）；4）載體的酶切、回收；5）將處理好的基因組 DNA片斷與載體連接；6）將重組子導(dǎo)入宿主細胞7）文庫的鑒定、收集、保存；確定文庫大小的方法：以在構(gòu)建的基因組文庫中任一基因存在的概率來衡量文庫的質(zhì)量或完備性，它與基因文庫最 低所含克隆數(shù)N （即文庫大?。┲g的關(guān)系可用下式表示:N = ln （ 1 -P ）/ln（ 1 -f ）其中：N :文庫所需的總克隆數(shù)；P:任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸熘校┑母怕剩?f:克隆片段的平均大小/生物基因組的大小。9. 基因文庫的類型包括哪兩種？各有什么特點？克隆均一性基因覆蓋率pBNA文庫大小不一包含部分基因基因組文庫大小基本

18、一致包含所有基因10. 一般質(zhì)粒DNA的構(gòu)型有哪幾種？在瓊脂糖凝膠電泳中的有何特點？超螺旋質(zhì)粒 DNA、開環(huán)質(zhì)粒 DNA、線狀質(zhì)粒 DNA在瓊脂糖凝膠電泳的特點是：電泳的泳動速度由大到小分別是：超螺旋質(zhì)粒DNA線狀質(zhì)粒DNA開環(huán)質(zhì)粒DNA11. 堿裂解法提取質(zhì)粒 DNA的原理，分析影響試驗結(jié)果的各種可能因素。堿裂解法原理：在堿性條件下，雙連DNA氫鍵斷裂，結(jié)構(gòu)破壞變性，環(huán)狀超螺旋質(zhì)粒不充分變性。在中性條件下變性質(zhì)?；謴?fù)原來構(gòu)型，而線性大分子細菌DNA不能復(fù)性呈不溶物而經(jīng)離心除去。（各種可能因素是上一屆的，具體其實大家可以根據(jù)那天師兄說的去寫）提取失?。?）洗去雙鏈時，將質(zhì)粒 DNA洗去；2）破

19、壁失敗，質(zhì)粒沒析出；3）加劑問題電泳失?。? ）電壓太高2）沒加染色劑3）膠穿孔4）電泳時間過長12. 電泳緩沖液使用一定時間后出現(xiàn)DNA在凝膠中跑不動現(xiàn)象的原因，有何解決辦法？原因：電泳緩沖液的離子的富集作用；解決方法：1更換成新配置的電泳緩沖液；2. 把電泳槽中的緩沖液倒出混勻后再重新使用13. 電泳的指示劑和染色劑有何區(qū)別，各自的作用是什么？指示劑一定要在電泳前加入，指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液；（一般為：溴酚蘭，二甲苯青）作用：預(yù)知電泳的速率及方向；使樣品呈現(xiàn)顏色，便于加樣；一些高濃度蔗糖或其它物質(zhì)增加DNA的密度，可以防止 DNA的擴散染色劑即可以在電泳前加入樣

20、液，又可以電泳后再對凝膠染色；（溴化已錠EB、硝酸銀、Goldview 染料）作用：呈現(xiàn)出核酸電泳后的帶型。第三章基因克隆的酶學(xué)基礎(chǔ)1、限制性核酸內(nèi)切酶的類型，基因工程常用的是哪種限制性核酸內(nèi)切酶？（常用II型）限制性內(nèi)切酶的種類I11111限制性活性十甲基化酶活性+DNA識別字列+切割特異性隨機對ATP依賴性+對胡g"依賴性+蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)3科不同亞基+專一+單一成令+切割燈點挺識別 fv5lO-25bP+2科不同的亞星2、什么是星活性，產(chǎn)生星活性的因素可能有哪些？在非最適合的條件下酶的識別特異性降低，產(chǎn)生非特異性帶，這種活性稱星活性。產(chǎn)生Star活性的因素：（書上P46-P47答案）

21、高濃度甘油，堿性 pH，存在Mn2+，低離子強度，低鹽濃度，低pH3、 結(jié)合已做的實驗，分析影響酶切的因素。（這個答案是上屆的，僅供參考）1） DNA的純度：DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都會影響酶的 活性。2） DNA的甲基化程度 ：dam甲基化酶（修飾GATC中的A）； dem甲基化酶（修飾CCA/TGG 的C）。3） 溫度：不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37 °C,少數(shù)要求40-65 °C。4）緩沖液（Buffer）:是影響限制酶活性的重要因素。MgCl2、NaCl/KCl :提供Mg2+和離子強度；Tris-HCl :維持

22、pH ；一硫蘇糖醇（DTT ）:保持酶穩(wěn)定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定；巰基乙醇：保持酶的穩(wěn)定性，防止酶失活4、限制性核酸內(nèi)切酶命名規(guī)則及各字母代表的含義。（例子和圖幫助大家理解而已）命名規(guī)則：寄主菌屬名的第1個字母+種名的前兩個字母+菌株或菌型代號（大寫）+空白+發(fā)現(xiàn)序列（羅馬數(shù)字）例子：EcoRI （E：屬名；co：種名；R:株；I:發(fā)現(xiàn)次序）屬名種名 菌株Haemophilus influenzae d嗜巾流感桿菌d株5、簡單敘述同尾酶和同裂酶的差別。連接后不能被相關(guān)的酶同同尾酶：來源不同，識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端,時切割。同裂酶：識別序列相同，切割位點有些相同

23、，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS:完全同裂酶：識別位點和切點完全相同。不完全同裂酶：識別位點相同，但切點不同。）6、連接酶主要有哪些類型？有何異同點？影響連接酶連接效果的因素主要有哪些？ 類型：DNA連接酶和RNA連接酶異同點：相同點：都能以 DNA為模板，從5'向3'進行核苷酸或脫氧核苷酸的聚合反應(yīng)。不同點：DNA聚合酶識別脫氧核糖核苷酸，在DNA復(fù)制中起作用；而 RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在轉(zhuǎn)錄中起作用。影響因素：（影響因素就四個，后面分析覺得煩的話大家自己看著辦啦）1）連接所用的目的片段的狀態(tài)：效率：粘性末端 >平端（100倍）；5,突出>3

24、，突出；平端：HaeHI>Alul>Hi nCII>Smal2）連接溫度連接效果最好在 37 C,但形成的互補不穩(wěn)定；最佳連接溫度：12-16 C,較好的連接效果，互補又較穩(wěn)定；3）反應(yīng)液中的成分：ATP :反復(fù)凍熔，ATP活性降低，ATP溶解度不高，連接緩沖液宜分裝；單價離子：150-200mM NaCl，提高連接效果；PEG: 5%以下可以提高連接效率4）插入片段與載體的濃度比例載體 DNA與外源 DNA的分子摩爾比通常為 1 ： 3左右，甚至1 ： 10或更高。 目的或作用：增加插入片段與載體的接觸機會，減少載體自我連接的現(xiàn)象。7、 試分析提高平端DNA連接效率的可能方

25、法。（傳說中的網(wǎng)上答案）1、低溫下長時間的連接效率比室溫下短時間連接的好。2、在體系中加一點切載體的酶，只要連接后原來的酶切位點消失。這樣可避免載體自 連，應(yīng)該可以大大提高平端連接的效率。3、 足夠多的載體和插入片段是最重要的。4、平端的連接對于離子濃度很敏感5、盡可能縮小連接反應(yīng)的體積6、 建議放在四度冰箱連接兩天效率更高比14度好8、基因工程中常用的 DNA聚合酶主要有哪些？1）大腸桿菌DNA聚合酶2）Klenow fragment3）T7 DNA聚合酶4）T4 DNA聚合酶5）修飾過的T7 DNA聚合酶6）逆轉(zhuǎn)錄酶7）Taq DNA聚合酶第四章基因克隆的載體系統(tǒng)7、作為基因工程載體，其應(yīng)

26、具備哪些條件？具有針對受體細胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）；具有合適的篩選標記；具有較高的外源 DNA的載裝能力；具有多克隆位點（MCS）；具有與特定受體細胞相適應(yīng)的復(fù)制位點或整合位點。8、質(zhì)粒的不相容性及其分子機理。定義：任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時存在于一個細胞中，這種現(xiàn) 象稱為質(zhì)粒的不相容性。分子機理：兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制同時受到同統(tǒng)的干擾,致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細胞分裂周期中更具優(yōu)勢。9、載體的類型主要有哪些？在基因工程操作中如何選擇載體？基因工程中常用的載體 （vector）主要包括質(zhì)粒（plasmid）、噬菌體

27、（phage）和病毒（virus）三大類。 這些載體均需經(jīng)人工構(gòu)建，除去致病基因，并賦予一些新的功能，如有利于進行篩選的標志 基因、單一的限制酶切點等。10、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原理，影響轉(zhuǎn)化率的因素有哪些？A、化學(xué)法（CaCI2法）轉(zhuǎn)化原理：是 Ca2+與細菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細胞膜出現(xiàn)空隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進入細胞內(nèi)（感受態(tài)細胞）。B、 電穿孔轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化原理：將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；駾NA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池 中，兩極施加高壓電場，在強大電場的作用下，細菌細胞壁和細胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；?DNA重組分子便可進入細胞內(nèi)。影響轉(zhuǎn)化率的主要影響因素 ：1）載

28、體本身的性質(zhì)及其空間構(gòu)象：超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高；2）插入片段的大?。翰迦肫卧酱?，轉(zhuǎn)化效率越低；3）受體細胞的類型及預(yù)處理；4）轉(zhuǎn)化方法：電擊法高于化學(xué)法。5、重組體分子的選擇方法主要有哪些？并簡單闡述其原理。從總體上看，重組體分子的選擇與鑒定方法基本上可以分為如下幾個類型：（1）基于載體遺傳標記檢測法在構(gòu)建基因工程載體系統(tǒng)時，載體DNA分子上通常攜帶了一定的選擇性遺傳標記基因，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞后可以使后者呈現(xiàn)出特殊的表型或遺傳學(xué)特性，據(jù)此可進行轉(zhuǎn)化子或重組子的初步篩選。（2 ）基于克隆DNA序列檢測法Southern印跡雜交：根據(jù)毛細管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在

29、適當?shù)臑V膜上，然后通過與已標記的單鏈 DNA探針的雜交作用以檢測這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段。（3）基于外源基因產(chǎn)物檢測法如果目的基因產(chǎn)物能降解某些藥物使菌株呈現(xiàn)出抗性標記，或者基因產(chǎn)物與某些藥物作用是顯顏色反應(yīng)，則可根據(jù)抗性或顏色直接篩選含目的基因的克隆子。6、 用已學(xué)過的重組體分子的選擇與鑒定技術(shù)，試設(shè)計一個試驗方案，假如一特異PCR擴出的基因或基因片斷重組進 T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，如何鑒定并獲得真實轉(zhuǎn)化子？（自理）第五章基因的克隆一般方法1、基因的克隆方法主要有哪些？并闡述其克隆原理（至少3種，都是書上找的，自選哈，建議必選DD RT-PCR和SSH,原因請看下題）？1）差減雜交（SH）通過D

30、NA復(fù)性動力學(xué)原理富集目的基因序列，并以此構(gòu)建減數(shù)文庫的方式來進行目的基因分離克隆的。2）抑制性差減雜交（SSH）SSH的核心技術(shù)是抑制性 PCR，它是一種將檢測子 cDNA單鏈標準化步驟和消減雜交步驟 結(jié)合為一體的技術(shù)。其中標準化步驟均等了檢測子中的cDNA單鏈豐度，而消減雜交步驟去除了檢測子和驅(qū)趕子之間的共同序列，使檢測子和驅(qū)趕子之間不同的序列得到擴增。3）差異顯示 PCR（ DD RT-PCR）利用真核生物 mRNA結(jié)尾處有POLY（A）結(jié)構(gòu)，在其3'端設(shè)計象5'-T11GA樣引物，該引 物可與mRNA總數(shù)的十二分之一結(jié)合，從而使這部分基因得到逆轉(zhuǎn)錄，同時結(jié)合5'

31、端的隨機引物（20條10-mer）,可以使不同長度的基因得到擴增。4）DNA代表性差異分析（DNA RDA ）代表性差別分析是通過突變型（驅(qū)趕DNA，driver DNA ）與野生型（檢測DNA，tester DNA ）基因組之間的差異來分離和鑒定突變基因的方法。5）擴增限制性片段長度多樣性（ AFLP ）基因組DNA經(jīng)過限制性內(nèi)切酶消化后，產(chǎn)生粘性末端。使用人工合成的短的雙鏈接頭，該 接頭一端具有同樣的內(nèi)切酶識別粘性末端，互補連接后成為DNA模板。接頭和與接頭相鄰的酶切片斷的幾個堿基序列作為引物的結(jié)合位點。參考文獻：關(guān)德軍.AFLP技術(shù)原理及其在植物研究中的應(yīng)用安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006 ,34

32、 （ 15 ）：3625-3628）6）cDNA微陣列建立一套統(tǒng)一且具有高質(zhì)量、高代表性的 cDNA列陣膜，在這一列陣膜上每個 cDNA克隆 都有固定的位置和編號，這樣大大方便了數(shù)據(jù)的綜合比較分析，并可對每個cDNA克隆子進行定量分析。在列陣雜交的基礎(chǔ)上，還可以進行雜交測序，從而測定每個cDNA克隆子的序列。2、簡單闡述差異顯示 PCR克隆基因的原理及其優(yōu)缺點，有何應(yīng)用？主要原理：利用真核生物 mRNA結(jié)尾處有POLY（ A）結(jié)構(gòu)，在其3'端設(shè)計象5'-T11GA樣 引物，該引物可與 mRNA總數(shù)的十二分之一結(jié)合，從而使這部分基因得到逆轉(zhuǎn)錄，同時結(jié) 合5'端的隨機引物（

33、20條10-mer），可以使不同長度的基因得到擴增。優(yōu)點：簡便、靈敏、高效、省時，能快速顯示mRNA的組成。所需的mRNA量少。各樣本mRNA的差異可同時進行比較。擴出的cDNA可直接用于測序、文庫篩選等。缺點：假陽性條帶多，對低豐度的基因表達不容易檢測。工作量大。無法定量研究。擴出的條帶往往是 3'端比較短的UTR區(qū)的一段序列，提供的信息較少。利用該技術(shù)，目前已有越來越多的差別表達基因得以分離和鑒定，在分子生物學(xué)和基因工程研究領(lǐng)域發(fā)揮了極大的作用。（P221）3、抑制性差減雜交的原理與應(yīng)用。原理：SSH的核心技術(shù)是抑制性 PCR，它是一種將檢測子 cDNA單鏈標準化步驟和消減雜 交步

34、驟結(jié)合為一體的技術(shù)。其中標準化步驟均等了檢測子中的 cDNA 單鏈豐度，而消減雜 交步驟去除了檢測子和驅(qū)趕子之間的共同序列，使檢測子和驅(qū)趕子之間不同的序列得到擴 增。應(yīng)用：基因突變體的研究：如基因的表達與不表達； 基因時空表達的研究：如根、莖、葉； 不同處理條件下的基因表達差異：如施肥與不施肥、光照與不光照。4、酵母雙雜交技術(shù)、噬菌體表面展示技術(shù)的原理。A 酵母雙雜交技術(shù)原理：大部分真核生物的位點特異轉(zhuǎn)錄激活因子通常具有兩個可分隔開 的結(jié)構(gòu)域，一個是 DNA 特異結(jié)合域( DNA-binging domain,BD )，一個是轉(zhuǎn)錄激活域 (transcriptional activation

35、domain,AD) 。這兩個結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響，但一個完整的、 具有激活特定基因表達的激活因子必須同時含有這兩個結(jié)構(gòu)域，否則無法完成其激活功能。 不同來源的激活因子的 BD 區(qū)與 AD 區(qū)結(jié)合后則能特異地激活 BD 結(jié)合基因的表達。B 噬菌體表面展示技術(shù)原理：當外源DNA片段插入絲狀噬菌體基因組的一個外被蛋白基因中時，如果兩者讀碼框結(jié)構(gòu)保持一致，這個外源 DNA 片段所編碼的產(chǎn)物可與此外被蛋白 一起以融合蛋白的形式表達， 并顯示在噬菌體的表面。 利用抗此外源基因編碼產(chǎn)物 (多肽或 蛋白)的抗體， 通過親和純化， 就能從大量的噬菌體中富集、 分離出含有所要的基因的融合 噬菌體。然后，通過

36、基因擴增，得到大量所要的目的基因。5、T-DNA 標簽法克隆基因的一般技術(shù)路線。? 農(nóng)桿菌侵染植物得到轉(zhuǎn)化苗，篩選出表現(xiàn)某種突變性狀的個體。? 建立突變體基因組文庫及野生型基因組文庫 .? 用 T-DNA 片段做 probe 篩選突變體文庫，獲得陽性克隆。? 用獲得的陽性克隆篩選野生型基因組文庫，獲得野生型的陽性克隆。? 把陽性克隆轉(zhuǎn)化突變體進行功能互補及進行測序分析。第七章 克隆基因的表達1、通過比較，分析大腸桿菌表達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng)各有何優(yōu)缺點。大腸桿菌表達外源基因的優(yōu)勢：全基因組測序，共有 4405 個開放型閱讀框架； 基因克隆表達系統(tǒng)成熟、完善；繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定

37、；被 FDA 批準為安全的基因工程受體生物。大腸桿菌表達外源基因的劣勢：缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能； 缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)； 內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白；周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素。甲醇酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)點：? 具有強的受嚴格調(diào)控的 AOX1 啟動子? 表達蛋白的翻譯后的加工和修飾? 營養(yǎng)要求低，工業(yè)化生產(chǎn)成本低? 可高密度發(fā)酵? 表達蛋白可存在于胞內(nèi)和胞外 酵母表達系統(tǒng)的缺點：酵母表達蛋白有時會出現(xiàn)蛋白切割問題(這個找不到，百度的)2、如何提高克隆基因的表達水平？1）、表達載體的優(yōu)化設(shè)計；2）、提高目標基因 mRNA 和目標基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性；3）、密碼子偏愛性；

38、4）、表達環(huán)境條件的優(yōu)化。3、克隆基因目的蛋白的表達的形式主要有哪些類型？ 表達蛋白按溶解特性通常包括： 不溶性蛋白和可溶性蛋白兩類， 具體包括如下幾種結(jié)構(gòu)形態(tài)： 包涵體型蛋白、融合型蛋白、分泌型蛋白4、啟動子從轉(zhuǎn)錄模式上可分為哪兩種？表達系統(tǒng)常選用哪一種？其機理是什么？ 啟動子從轉(zhuǎn)錄模式上分為：組成型啟動子和誘導(dǎo)型啟動子表達系統(tǒng)常選用誘導(dǎo)型啟動子 機理：指在某些特定的物理或化學(xué)信號的刺激下， 該種類型的啟動子可以大幅度地提高基因 的轉(zhuǎn)錄水平。11、表達載體和基因工程一般克隆載體在元件構(gòu)成上有何差別？表達載體： 啟動子； 終止子； 核糖體結(jié)合位點 （ SD 序列）；篩選標記； 復(fù)制子 （質(zhì)?？?/p>

39、貝數(shù)） ； 多克隆位點克隆載體：篩選標記；復(fù)制子（質(zhì)?？截悢?shù)） ；多克隆位點12、根據(jù)表達蛋白用途的不同，設(shè)計選擇基因的表達策略。（1）表達蛋白用于生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究 主要考慮保持蛋白質(zhì)原有的功能不變；表達策略：融合表達和直接表達（2）表達蛋白用作抗原 主要考慮表達蛋白的快速提純；表達策略：以包涵體形式合成 目的蛋白和融合表達目標蛋白（不用去除標簽蛋白）（3）表達蛋白用作結(jié)構(gòu)研究 表達蛋白以天然可溶形式產(chǎn)生；表達時考慮因素：表達溫 度（高溫促進包涵體的形成） ；表達水平（高表達促成包涵體的形成） ；表達載體受體菌。第八章 植物基因工程 1、什么叫轉(zhuǎn)基因植物？植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基本路線主要包

40、括哪些？ 利用 DNA 重組技術(shù)，在離體條件下對不同生物的 DNA 進行加工，并按照人們的意愿和適 當?shù)妮d體重新組合，再將重組 DNA 轉(zhuǎn)入生物體或細胞內(nèi)，并使其在生物體內(nèi)或細胞中表達 的植物。植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基本路線分離目的基因 目的基因與恰當?shù)妮d體 DNA 形成重組 DNA 重組 DNA 的擴增 目的基因?qū)氲绞荏w細胞篩選轉(zhuǎn)化細胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株 轉(zhuǎn)基因植株的大規(guī)模種植2、外源基因?qū)胫参锏姆椒ㄖ饕心男?物理方法：電擊法、基因槍法 （biolistic） 、顯微注射法、微激光束法 化學(xué)方法： PEG 介導(dǎo)法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法 生物學(xué)方法：農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通道法3、運用已學(xué)的知識，如

41、何全面分析獲得的轉(zhuǎn)基因個體（提示：包括外源基因是否整合，被插入位點分析，外源基因是否表達，表達量如何？等）對轉(zhuǎn)基因個體進行檢測與鑒定的對象 報告基因 目的基因(1) 基因組水平的檢測與鑒定(外源基因是否整合，被插入位點分析) ： 可以用 PCR 擴增結(jié) 合 Southern Blotting 進行驗證。(2) 基因的轉(zhuǎn)錄 /表達水平的檢測與鑒定 (外源基因是否表達 ): 可用 RT-PCR 法或者 Northern Blotting 。(3) 基因的翻譯水平的檢測與鑒定 (表達量)：可用 Western Blotting 或者 ELISA 。對報告基因 來講，還可以利用報告基因的顯色或發(fā)光特性

42、進行選擇與 鑒定4、出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象的可能原因分析。(1)位置效應(yīng)：指插入部位及其周圍序列對外源基因的影響(2) DNA 甲基化：包括編碼序列和啟動子的甲基化(3) 重復(fù)序列誘發(fā)基因沉默：多拷貝串聯(lián)重復(fù)序列易引起外源基因的失活；(4) 共抑制(co-suppression)：具有部分同源性的外源基因和植物內(nèi)源基因相互作用引起的沉 默現(xiàn)象。轉(zhuǎn)基因食品的危害有哪些轉(zhuǎn)基因食物的五大隱患雖然轉(zhuǎn)基因食品研究歷史只有短短幾十年， 但其提高產(chǎn)量、 增強自身抗病抗 蟲等優(yōu)點較為明顯，另一方面，其潛在的風險，如過敏性、毒性及對環(huán)境影響也 令世人關(guān)注。首先是毒性問題。 一些研究學(xué)者認為， 對于基因的人工提煉和添加， 可能在 達到某些人們想達到的效果的同時，也增加和積聚了食物中原有的微量毒素。其次是過敏反應(yīng)問題。 對于一種食物過敏的人有時還會對一種以前他們不過 敏的食物產(chǎn)生過敏， 比如：科學(xué)家將玉米的某一段基因加入到核桃、 小麥和貝類 動物的基因中， 蛋白質(zhì)也隨基因加了進去， 那么， 以前吃玉米過敏的人就可能對 這些核桃、小麥和貝類食品過敏。第三是營養(yǎng)問題。科學(xué)家們認為外來基因會以一種人們目前還不甚了解的方 式破壞食物中的營養(yǎng)成分。第四是對抗生素的抵抗作用。 當科學(xué)家把一個外來基因加入到植物或細菌中 去，這個基因會與別的基因連接在一起。 人們在