微生物來源的醛糖還原酶抑制劑的研究進(jìn)展

1、微生物來源的醛糖還原酶抑制劑的研究進(jìn)展<    【關(guān)鍵詞】   醛糖還原酶抑制劑； 糖尿病并發(fā)癥； 微生物來源    ABSTRACT  Diabetic complications is related to the activation of polyalcohol pathway. Aldose reductase is a key ratelimiting enzyme in the pathway, while aldose reductase inhibitors can inhibit

2、 the pathway and alleviate the symptoms of diabetic complications. This review mainly gives a brief account of the progress of research on aldose reductase inhibitors from microorganisms.    KEY WORDS  Aldose reductase inhibitors;  Diabetic complications;  Microbial ori

3、gin    糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種多病因的代謝性疾病，其特征之一就是葡萄糖代謝異常和某些 組織 中高血糖狀態(tài)。1995年，世界衛(wèi)生組織 統(tǒng)計(jì) 全世界糖尿病在成人中發(fā)病率為4%，預(yù)計(jì)在2025年將達(dá)到8%1。盡管可以用胰島素對糖尿病患者進(jìn)行 治療 ，但還是會留下危及許多組織和器官的糖尿病并發(fā)癥(diabetic complications)，如糖尿病性白內(nèi)障、動脈粥樣硬化、周圍神經(jīng)疾病、腎臟病變和視網(wǎng)膜病變等2。糖尿病并發(fā)癥不僅威脅人類健康和生命安全，降低生活質(zhì)量，而且?guī)沓林氐?經(jīng)濟(jì) 負(fù)擔(dān)。    

4、 1  醛糖還原酶與糖尿病并發(fā)癥     現(xiàn)有的大量研究表明，多元醇通路激活是繼發(fā)性糖尿病并發(fā)癥主要原因。糖尿病并發(fā)癥與糖代謝的多元醇通路(圖1)激活有關(guān)。 多元醇通路由醛糖還原酶圖1    多元醇通路         AR是多元醇通路的關(guān)鍵限速酶，在正常血糖濃度時AR并不被激活，活性不高，代謝率極低，但如血糖濃度超過正常生理水平，催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為6磷酸葡萄糖的己糖激酶被飽和，AR將被激活，葡萄糖的代謝速率增加24倍，促使體內(nèi)的葡萄糖轉(zhuǎn)化成山梨醇

5、。但山梨醇脫氫酶的活力并未呈比例地相應(yīng)增加，山梨醇又由于自身極性大而不易通過細(xì)胞膜，所以在細(xì)胞內(nèi)造成了山梨醇的蓄積，造成細(xì)胞滲透性水腫，改變細(xì)胞膜的通透性，同時細(xì)胞內(nèi)山梨醇大量蓄積也可使Na+、K+ATP酶活性下降，細(xì)胞中肌醇流失，導(dǎo)致細(xì)胞代謝與功能的損害，出現(xiàn)糖尿病并發(fā)癥等器官病變。    通過抑制AR的活性能減少山梨醇的生成，有效防止和改善糖尿病并發(fā)癥，所以，通過以AR為靶點(diǎn)醛糖還原酶抑制劑(aldose reductase inhibitors，ARIs)的篩選研究 工作 ，成為糖尿病并發(fā)癥治療藥物開發(fā) 熱點(diǎn) 。     2&#

6、160; ARIs篩選模型的研究     任何藥物的開發(fā)都離不開一個有效的篩選模型。針對AR為靶點(diǎn)的ARIs篩選，分為體內(nèi)篩選和體外篩選，體內(nèi)篩選是利用動物模型進(jìn)行篩選，而體外篩選分為無細(xì)胞相水平篩選和細(xì)胞相水平篩選。    實(shí)驗(yàn)中的AR主要來源于大鼠、牛、豬、人和兔。1965年，Selma等首次從小牛的晶狀體中分離到AR，并對AR的制備、活性測定及性質(zhì)作了詳細(xì)的闡述。該法是取小牛晶狀體，經(jīng)勻漿、離心后，上清中加入不同濃度的硫酸銨溶液去雜質(zhì)，最后加75%硫酸銨飽和溶液，得到粗酶制品，再經(jīng)透析、DEAEcellulose柱層析獲得純品。

7、后來又制備了不同動物來源的AR，方法大多類似。    糖尿病動物模型是最早用來篩選ARIs的模型，目前廣泛 應(yīng)用 的是體外篩選模型。體外篩選模型是先培養(yǎng)糖尿病動物模型即四氧嘧啶(alloxan)誘導(dǎo)模型和鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)模型，而后取血，體外測定AR的活性變化，作為評價(jià)ARIs的重要指標(biāo)。測定紅細(xì)胞中AR活性的方法有分光光度法、熒光法和ELISA法。利用無細(xì)胞相水平篩選ARIs是直接用純化的AR在人工反應(yīng)體系中測定化合物對AR活性的抑制作用。    應(yīng)用96孔石英板成功建立的ARIs的微量高效篩選模

8、型，較傳統(tǒng)的石英比色皿法效率提高10倍之多，此模型簡便易行、成本低，可以篩選多來源的化合物，并且利用此模型開展了從生物產(chǎn)物中篩選ARIs的工作，已累計(jì)篩選真菌和稀有放線菌樣品1500個，其中陽性樣品6個，說明該模型有效5。閆泉香等6利用體外細(xì)胞培養(yǎng)研究了黃酮類ARIs的活性，通過測定樣品對紅細(xì)胞山梨醇生成的影響來測定化合物的抑制作用。通過組織貼塊法培養(yǎng)大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞，高效液相色譜測定反應(yīng)體系中反應(yīng)后剩余的醛糖還原酶的輔酶NADPH的熒光強(qiáng)度，推算出反應(yīng)體系中醛糖還原酶的活性，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RTPCR)檢測醛糖還原酶mRNA的表達(dá)，這種方法簡便、可靠，既可以用于高通量ARIs篩選，

9、也可在此模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行相關(guān)的藥物篩選以及藥物作用機(jī)制的研究7。劉英華等8從大鼠晶狀體中提取AR，通過改變酶促反應(yīng)條件最終確立整個反應(yīng)體系的組成，建立了ARIs篩選模型，并利用此模型檢測槲皮素對AR的抑制作用。     3  微生物來源的ARIs     ARIs來源主要有：由化學(xué)合成制備，主要代表有托瑞司他(tolrestat)和依帕司他(epalresta)；從植物篩選得到，代表化合物槲皮素；從微生物篩選得到。從微生物的代謝產(chǎn)物中尋找有潛在治療價(jià)值的藥物，一直是科研工作者的首選目標(biāo)，ARIs也不例外，在這一方面，日本學(xué)者

10、做了許多研究，取得了一定的成績。截止目前，已從微生物產(chǎn)物中篩選出20多種ARIs，并且有的ARIs的IC50值很小，主要來源于真菌和放線菌，而細(xì)菌來源的目前尚沒有相關(guān)報(bào)道。    微生物是化合物多樣性的重要來源，它們中許多具有生物活性或藥用特性。微生物來源的潛在ARIs種類豐富，建立ARIs化合物庫，分析其構(gòu)效關(guān)系，找到必需基團(tuán)，可為ARIs化合物提供合成的前體；從目前已分離到的微生物來源的ARIs出發(fā)，找出它們共有的特征，也可啟發(fā)人們設(shè)計(jì)更高活性的ARIs。以下就近年來從微生物來源中所得到的ARIs的種類及活性(體外測定)研究做一概括的介紹。 

11、0;  最早從微生物中得到ARIs是Nishikawa等9報(bào)道的，他們在日本福崗地區(qū)土壤中篩選到真菌Chaetomella raphigera，從其發(fā)酵液乙酸乙酯部分分離得到WF3681(2，圖2)對兔晶狀體AR具有抑制活性，其IC50為0.25mol/L，活性明顯高于IC50為0.42mol/L的索比尼爾對照樣品；后來合成出WF3681的一系列衍生物，并且分析了構(gòu)效關(guān)系，實(shí)驗(yàn)證明WF3681及其衍生物均能抑制糖尿病大鼠中的山梨醇積累，其中的一種衍生物(3，圖2)效果最好。    Aldostatin(5，圖2)是從日本土壤中篩選到的真菌Pseudeur

12、otium zonatum M4107代謝產(chǎn)物，對牛晶狀體AR有抑制活性11。后來從灰色腐質(zhì)霉Humicola grisea的代謝物中篩選到一種Aldostatin結(jié)構(gòu)類似物WF2421(6，圖2)，這種類似物對兔晶狀體AR有顯著的抑制作用，其IC50為0.03mol/L12。    從Crucibulum sp. RF3817的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到對鼠晶狀體醛糖還原酶(RLAR)顯示較強(qiáng)抑制的活性物質(zhì)Salfredins A3、A4、A7、C1、C2、C3和B11等7種化合物，其中A4、B11(7、8，圖2)活性較高，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)它們都含有一個甘氨酸基團(tuán)，此基團(tuán)

13、與抑制活性有密切相關(guān)13。    在青霉屬的Penicillium citrinum發(fā)酵液中分離得到對RLAR有抑制作用的桔霉素(9，圖2)；此外，在另一種青霉屬的P.corylophilum也分離到對RLAR有抑制作用的化合物DHMI(10，圖2)，它們的IC50都在10mol/L左右。以這兩種化合物為基礎(chǔ)的衍生物已被合成和進(jìn)一步研究，其中之一的dihydrocitrinin(11，圖2)是對AR的一種不可逆抑制劑，并且有穩(wěn)定有效的活性14。最近Lu等15從海洋真菌Penicillium    圖2   

14、; 微生物來源的部分ARIs化學(xué)結(jié)構(gòu)式citrinum B57中也分離到桔霉素衍生物，對RLAR的IC50為0.8mol/L。    Yoshida等16從真菌屬的Chaetomella circinoseta代謝產(chǎn)物中分離得到了對RLAR有抑制作用的化合物(12，圖2)，其IC50為0.016mol/L，效果明顯好于IC50為0.027mol/L的對照組托瑞司它。    從嗜堿棒狀桿菌Corynebacterium sp.發(fā)酵液中分離得到的YUA001(13，圖2)對豬腎AR的抑制活性IC50為1.8×10-3mol/L1

15、7。強(qiáng)翔等18應(yīng)用ARIs微量高效篩選模型對數(shù)千株陽性菌株進(jìn)行篩選，其中灰色鏈霉菌SIPI99807的代謝產(chǎn)物5，7二羥基3(4羥基苯酚)4氫1苯并吡喃4酮(14，圖2)對牛眼晶狀體AR有抑制活性。后來，任曉等19從云南篩選得到N99253菌株，發(fā)酵分離獲得了結(jié)構(gòu)類似物質(zhì)異黃酮類化合物7(L鼠李糖基)5羥基3(4羥基苯酚)4氫1苯并吡喃4酮(N99253B)(15，圖2)，針對豬晶狀體AR活性測定IC50為75g/ml19。    2002年Rao等20從黑曲霉Aspergillus niger CFRW105菌株代謝產(chǎn)物中分離得到nigerloxin(16，圖2

16、)，它對RLAR的IC50值為69mol/L。2003年Rao等21又從Aspergillus niger CFR1046菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到asperaldin，對AR顯示較強(qiáng)的抑制作用，IC50為27mol/L。    Fujita等22從曲霉Aspergillus sp.HK388的發(fā)酵液中分離出對人重組體AR(HRAR)呈抑制活性的黃酮類化合物8羥基黃豆苷元(8hydroxydaidz Ei n)(17，圖2)，其IC50為4.2mol/L；對照品為一種常用黃酮類物質(zhì)槲皮素，其IC50為2.7mol/L，活性弱于槲皮素，8羥基黃豆苷元表現(xiàn)為非競爭性抑制

17、。研究發(fā)現(xiàn)，與8羥基黃豆苷元結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)黃豆苷元在100mol/L時對HRAR也不能表現(xiàn)出任何活性，從結(jié)構(gòu)上發(fā)現(xiàn)可能是在環(huán)上的鄰二羥基決定其是否有活性。    2005年Dong等23從云南土壤的Streptomyces diannanensis中分離出了兩種異黃酮鼠李吡喃糖苷類化合物N99596A和B(18、19，圖2)，它們對AR的體外IC50分別為170和165mol/L。    2006年任曉等24利用高通量ARIs篩選方法，從數(shù)千株放線菌和真菌中篩選得到陽性菌株鄔氏黃絲曲霉(Talaromyces wortmannii)，并從發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到活性化合物F01195A(20，圖2)，其對豬晶狀體有抑制作用，IC50為57.2mol/L。Chidananda等從青霉屬的Penicillium frequentans發(fā)酵液中分離得到一種有效的ARIs核叢青霉素(21，圖2)，對RLAR的IC50為0.4mol/L，其活性顯著高于同一實(shí)驗(yàn)室的所發(fā)現(xiàn)的ARIsnigerloxin和asperaldin20，21，25。    最近，有從大型真菌的子實(shí)體中抽提分離得到ARIs的報(bào)道。Sanghyun等26從靈芝Gano