土壤鎘、鋅污染對蚯蚓纖維素酶活性的影響

1、土壤鎘、鋅污染對蚯蚓纖維素酶活性的影響王慧，張玉龍*，黨秀麗，任琳，姬景紅，虞娜沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院/遼寧省農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110161摘要：為了探究土壤鎘、鋅污染對土壤動(dòng)物蚯蚓的生理毒害情況，為土壤生態(tài)環(huán)境質(zhì)量評價(jià)提供數(shù)據(jù)支持，以赤子愛勝蚓（Eisennia foetida）為研究對象，采用自然土壤法進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，研究了土壤外源添加鎘（Cd）和鋅（Zn）單一污染與復(fù)合污染對蚯蚓纖維素酶活性的毒性效應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，蚯蚓體內(nèi)纖維素酶活性在培養(yǎng)過程中呈先增大后減小的變化趨勢。單一污染試驗(yàn)，酶活性的最大值出現(xiàn)在第7至第9天，最小值出現(xiàn)在第14天；復(fù)合污染試驗(yàn)，同一處

2、理不同培養(yǎng)時(shí)間的酶活性最小值也大多出現(xiàn)在第14天。土壤Cd和Zn單一及復(fù)合污染都會對蚯蚓體內(nèi)纖維素酶活性產(chǎn)生抑制作用。單一污染在培養(yǎng)的前5天抑制效果明顯，且隨著污染物添加劑量的增加抑制效果增強(qiáng)。復(fù)合污染，鎘和鋅在土壤中的聯(lián)合效應(yīng)除個(gè)別測定結(jié)果表現(xiàn)為加和作用或協(xié)同作用外，多數(shù)處理都表現(xiàn)為拮抗作用，且主要是受體拮抗。相比較而言，鎘對蚯蚓體內(nèi)纖維素酶活性的抑制作用強(qiáng)于鋅。關(guān)鍵詞：蚯蚓；纖維素酶；鎘；鋅；單一污染及復(fù)合污染；急性暴露試驗(yàn) 中圖分類號：X174；X171.5；X503；X53 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-2175（2008）02-0661-05隨著工業(yè)化進(jìn)程的加快和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的

3、不斷擴(kuò)大，我國的土壤重金屬污染情況也日趨嚴(yán)重1。鎘和鋅是土壤中常見的具有代表性的重金屬污染物。同時(shí)土壤中的重金屬污染多為伴生的或復(fù)合的，即多種重金屬元素同時(shí)存在2。然而，到目前為止大多數(shù)研究都僅限于污染土壤重金屬含量方面的研究。事實(shí)上，重金屬進(jìn)入土壤后必然對土壤生物的生態(tài)條件產(chǎn)生影響，導(dǎo)致土壤生態(tài)環(huán)境惡化、生態(tài)功能低下，土壤生態(tài)過程受阻，進(jìn)而改變土壤中物質(zhì)、能量的循環(huán)乃至對一個(gè)區(qū)域生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生破壞作用。蚯蚓是世界上數(shù)量最多的陸生動(dòng)物之一，作為土壤中的植食性動(dòng)物承擔(dān)著分解土壤中有機(jī)物質(zhì)的任務(wù)，與土壤中其他的動(dòng)物、植物和微生物相互影響，因此，利用蚯蚓指示土壤污染狀況，已被作為土壤污染生態(tài)毒理診斷的

4、一項(xiàng)重要指標(biāo) 3。表1 供試土壤的基本理化性質(zhì)Table l Basic properties of the tested soilpH(H2O)有機(jī)質(zhì)OM/(g·kg-1)CEC/(cmol·kg-1)CaCO3/(g·kg-1)重金屬元素含量/(mg·kg-1)CdZn6.515.616.37.50.1253.75蚯蚓體內(nèi)的纖維素酶在蚯蚓分解土壤中有機(jī)物質(zhì)過程中起著重要作用4，因此纖維素酶的活性變化可以用來指示蚯蚓生命活動(dòng)狀況，間接地反映土壤生態(tài)條件。土壤遭受污染之后，其生態(tài)條件改變，蚯蚓體內(nèi)纖維素酶也會改變，可見研究蚯蚓纖維素酶對于土壤生態(tài)毒理學(xué)研

5、究有著重要的意義。然而，目前國內(nèi)外關(guān)于蚯蚓纖維素酶活性的毒理學(xué)研究尚少，已有的關(guān)于土壤蚯蚓纖維素酶的研究多數(shù)集中于農(nóng)藥類土壤污染評價(jià)方面。東北是我國老工業(yè)基地，受到重金屬污染的土壤面積較大，評價(jià)重金屬污染土壤的生態(tài)狀況既有理論意義，也有現(xiàn)實(shí)意義；本文對土壤重金屬污染與蚯蚓纖維素酶之間的關(guān)系進(jìn)行了研究，同時(shí)就以蚯蚓纖維素酶指示評價(jià)土壤生態(tài)狀況、判斷土壤污染程度的可能性進(jìn)行了討論。1 材料與方法1.1 供試材料1.1.1 供試污染物污染物Cd，為分析純CdCl2·2.5 H2O試劑；污染物Zn，為分析純ZnSO4·7H2O試劑。1.1.2 供試蚯蚓赤子愛勝蚓(Eisenia f

6、oetida)，購自天津賈立明蚯蚓養(yǎng)殖中心。試驗(yàn)前進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)試驗(yàn)，選擇環(huán)帶明顯，體質(zhì)量為300400 mg、大小基本一致的健康蚯蚓。1.1.3 供試土壤本試驗(yàn)采用自然土壤法進(jìn)行。供試土壤取自沈陽東陵農(nóng)田，土壤類型為棕壤，質(zhì)地為壤土。取樣深度為020 cm；土樣取回后自然風(fēng)干，過10目尼龍篩備用。供試土壤的基本理化性質(zhì)列于表1。1.1.4 污染物添加劑量設(shè)計(jì)本文以下所述的劑量均指外源添加劑量。正式試驗(yàn)前進(jìn)行濃度范圍選擇試驗(yàn)，以確定添加重金屬劑量；按添加重金屬后使蚯蚓生理活性明顯受阻但為低死亡狀態(tài)的要求，土壤污染物添加劑量上限確定為LD10。單一重金屬污染Cd的試驗(yàn)添加劑量系列為0、50、100、

7、150、200和250 mg·kg-1，Zn的試驗(yàn)添加劑量系列為0、50、150、250、350和450 mg·kg-1。復(fù)合污染試驗(yàn)Cd和Zn的劑量分別為50、100、150 mg·kg-1和50、150、250 mg·kg-1，各劑量完全組合得9個(gè)處理。每一個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。1.2 主要儀器設(shè)備 人工氣候箱，培養(yǎng)瓶，高速勻漿機(jī)，冷凍離心機(jī)，紫外-可見分光光度計(jì)。1.3 試驗(yàn)方法試驗(yàn)參照OECD guideline No207方法進(jìn)行5。1.3.1 供試土壤與蚯蚓的預(yù)處理 取烘干土500 g按設(shè)計(jì)重金屬劑量要求均勻加入重金屬溶液后，調(diào)節(jié)土壤含水量為田間持

8、水量的60%，靜置48 h；在此期間應(yīng)保持容器密閉狀態(tài)以防止水分逸失。把濾紙放在潔凈容器的底部，向?yàn)V紙噴灑蒸餾水，使其濕潤。將已在人工氣候箱中適應(yīng)培養(yǎng)2 d后的蚯蚓自人工氣候箱中取出，用蒸餾水洗凈，用濾紙吸干其體表水分，放在潔凈容器底部的濾紙上，靜置3 h，使其排除腸道內(nèi)的內(nèi)容物。1.3.2 培養(yǎng)試驗(yàn)先將經(jīng)過預(yù)處理的土壤放入容積為1L的透明硬質(zhì)塑料瓶內(nèi)，再挑選健康、體態(tài)均勻的經(jīng)過預(yù)處理的蚯蚓10條，置于其中；瓶口用紗布封好。將各塑料瓶放入人工氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng)。箱中溫度為(20±1) ，相對濕度為(75±5)，按12 h光照、12 h黑暗做交替光照處理，光照時(shí)其強(qiáng)度為1333

9、 lx6。1.3.3 蚯蚓纖維素酶活性的測定分別于培養(yǎng)開始后的1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d和14 d，取出培養(yǎng)瓶中的蚯蚓，測定蚯蚓體內(nèi)的纖維素酶活性。測定方法如下：蚯蚓體內(nèi)纖維素酶的提取采用Mishra7方法的改進(jìn)法進(jìn)行。具體做法是將蚯蚓洗凈，吸干水分，放入0 蒸餾水中用高速勻漿機(jī)在低溫條件下勻漿。勻漿后的液體放入冷凍離心機(jī)內(nèi)在0 條件下以2500 r·min-1離心，吸出上清液在同樣條件下，以3000 r·min-1進(jìn)行第二次離心，第二次離心后的上清液即為纖維素酶的待測液。纖維素酶活性的測定采用羧甲基纖維素法進(jìn)行8。2 結(jié)果與討論2.1 添加鎘對土壤中

10、蚯蚓纖維素酶活性的影響圖1是在不同鎘添加劑量土壤培養(yǎng)蚯蚓纖維素酶活性測定結(jié)果。從圖中可以看出，土壤添加鎘后蚯蚓體內(nèi)纖維素酶活性下降，即土壤鎘對蚯蚓體內(nèi)纖維素酶具有抑制作用。在整個(gè)試驗(yàn)過程中，鎘處理土壤培養(yǎng)的蚯蚓纖維素酶活性均低于對照處理。在毒性培養(yǎng)試驗(yàn)的第1天、第3天和第5天，隨著鎘的添加劑量增加，纖維素酶在蚯蚓體內(nèi)的活力水平逐漸降低，鎘質(zhì)量分?jǐn)?shù)與蚯蚓體內(nèi)纖維素酶活性呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（r1d=0.981*，r3d=0.999*，r5d=0.991*，r0.01=0.917）；這說明在這一時(shí)期，蚯蚓體內(nèi)纖維素酶活性明顯地受到污染物鎘的抑制，并且鎘的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大，抑制作用越強(qiáng)。到了培養(yǎng)的第7天，

11、各處理酶活性顯著增強(qiáng)，這可能是由于蚯蚓經(jīng)過適應(yīng)階段后，取食能力尤其是取食土壤中纖維素物質(zhì)的能力大大增強(qiáng)所致；在6個(gè)添加劑量處理中，以對照處理為最高、200 mg·kg-1添加劑量處理最低；即除去250 mg·kg-1鎘添加劑量處理外，其他各處理劑量與蚯蚓纖維素酶活性之間亦呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。從培養(yǎng)第9天起，鎘添加劑量與蚯蚓纖維素酶活性之間相關(guān)關(guān)系的規(guī)律性不明顯。尤其培養(yǎng)第14天時(shí)，土壤蚯蚓纖維素酶活性總體上已經(jīng)低于培養(yǎng)初期，且各處理間的差異不顯著。究其原因，這可能是在剛開始培養(yǎng)時(shí)，蚯蚓對重金屬鎘十分敏感，致使其體內(nèi)纖維素酶活性受到抑制；隨著時(shí)間推移，蚯蚓對鎘產(chǎn)生抗性，時(shí)間越長蚯蚓

12、纖維素酶受添加鎘的影響程度越來越不明顯。2.2添加鋅對土壤中蚯蚓纖維素酶活性的影響如圖2所示，添加Zn后土壤中蚯蚓體內(nèi)纖維素酶活性變化與添加Cd的情況相似，即與對照相比，每次測定添加Zn處理的蚯蚓體內(nèi)纖維素酶活性均有所降低。第1天、第3天和第5天測定結(jié)果，蚯蚓體內(nèi)纖維素酶活性隨著鋅添加量增加而降低，且添加劑量與蚯蚓體內(nèi)纖維素酶活性之間呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（r1d=0.998*，r3d=0.995*，r5d=0.990*，r0.01=0.917）。第7天和第9天測定結(jié)果為蚯蚓體內(nèi)纖維素酶活性明顯上升，Zn添加量與蚯蚓體內(nèi)纖維素酶活性也呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，但相關(guān)程度不及前三次測定結(jié)果。而第11天和第14天

13、兩次測定結(jié)果，蚯蚓體內(nèi)酶活性較第9天測定結(jié)果逐步下降，而且與添加劑量之間關(guān)系的變化愈加不明顯。對比添加鎘與添加鋅土壤中蚯蚓體內(nèi)纖維素酶活性，在添加數(shù)量相同情況下，鎘對土壤中蚯蚓纖維素酶活性的作用要高于鋅。說明對于蚯蚓體內(nèi)纖維素酶活性而言，鎘的毒性要強(qiáng)于鋅。2.3鎘、鋅同時(shí)添加對蚯蚓纖維素酶活性的影響為了表述方便，用Cd1、Cd2、Cd3代表Cd添加量50 mg·kg-1，100 mg·kg-1和150 mg·kg-1處理，用Zn1、Zn2、Zn3依次代表Zn添加量50 mg·kg-1、150 mg·kg-1和250 mg·kg-1處理

14、。圖3、4、5是Zn1、Zn2、Zn3添加劑量下，不同添加劑量Cd土壤蚯蚓纖維素酶活性的測定結(jié)果。在鋅添加劑量為Zn1的情況下，總體看在培養(yǎng)的第7或第9天，蚯蚓體內(nèi)纖維素酶活性出現(xiàn)最大值，以后再逐漸降低。各處理取樣測定結(jié)果蚯蚓體內(nèi)纖維素酶活性變化與添加鎘劑量之間的關(guān)系規(guī)律性不強(qiáng)。在添加Cd 基礎(chǔ)上再添加Zn處理，與僅添加等量的Cd處理（圖1）和僅添加50 mg·kg-1的Zn處理（圖2）相比，蚯蚓體內(nèi)纖維素酶活性降低不明顯，Cd1Zn1處理聯(lián)合作用表現(xiàn)為拮抗作用；Cd2Zn1處理的聯(lián)合作用只在第1天表現(xiàn)為協(xié)同作用，而在其他培養(yǎng)時(shí)期都表現(xiàn)為拮抗作用；在Cd3Zn1添加劑量下，與前兩個(gè)處

15、理相比，表現(xiàn)協(xié)同作用的培養(yǎng)天數(shù)增多，但拮抗作用仍占據(jù)主導(dǎo)地位。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分析拮抗作用的機(jī)理，作為功能拮抗、化學(xué)拮抗和干擾拮抗的可能性較小。從單一污染及復(fù)合污染的測定結(jié)果可以看出，兩種外源化學(xué)物質(zhì)競爭與同一受體（纖維素酶）作用，從而彼此消弱了各自的生物學(xué)效應(yīng)。因此，鎘和鋅對于蚯蚓纖維素酶活性的拮抗作用機(jī)制為受體拮抗的可能性最大。在Zn2添加劑量下，開始培養(yǎng)后的第1天、第3天和第5天，隨培養(yǎng)時(shí)間增長蚯蚓體內(nèi)纖維素酶活性呈逐漸降低的趨勢，而在每一天蚯蚓纖維素酶活性又隨著Cd添加量增加而下降，這說明土壤添加重金屬鎘后短時(shí)間內(nèi)會對蚯蚓纖維素酶活性產(chǎn)生抑制作用。培養(yǎng)第7天、第9天和第11天蚯蚓纖維素酶

16、活性表現(xiàn)出增高的趨勢，但在各鎘添加劑量之間沒有表現(xiàn)出明顯的規(guī)律性。到培養(yǎng)的第14天，各添加劑量處理的蚯蚓纖維素酶活性明顯下降，但與添加劑量之間并沒有表現(xiàn)出規(guī)律性。僅在Cd1Zn2處理的第9天和Cd2Zn2處理的第14天表現(xiàn)拮抗作用及Cd2Zn2處理的第9天表現(xiàn)加和作用，其余測定結(jié)果均表現(xiàn)為拮抗作用。從圖中可以看出，當(dāng)鋅的添加劑量為Zn3時(shí)，在培養(yǎng)開始后的第1天、第3天和第5天，蚯蚓體內(nèi)纖維素酶活性隨著鎘的添加劑量增加而呈下降趨勢，第7天以后的變化亦呈隨培養(yǎng)時(shí)間增長而先上升后下降的變化趨勢，但鎘添加劑間無明顯的規(guī)律性。除了Cd2Zn3、Cd3Zn3兩處理在末期各出現(xiàn)一天的協(xié)同作用外，其他也都表現(xiàn)

17、為拮抗作用。比較圖3、4、5中鋅添加劑量Zn1、Zn2和Zn3，在Cd1添加劑量下，培養(yǎng)的第3天和第5天隨著鋅添加量的增加酶活性出現(xiàn)緩慢遞增的趨勢。鎘添加劑量為Cd3時(shí)，在第5天也出現(xiàn)了類似情況。而在培養(yǎng)中期同一Cd不同Zn添加量的處理，測定結(jié)果酶活性隨鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)的改變而變化劇烈。到了培養(yǎng)末期，纖維素酶活性數(shù)值均不同程度減小。將這一系列變化與同一Zn不同Cd添加量相比，說明在復(fù)合污染鋅對于蚯蚓纖維素酶活性的影響力要弱于鎘。這一點(diǎn)與單一污染試驗(yàn)結(jié)果相一致。3 結(jié)論本文通過測定蚯蚓體內(nèi)纖維素酶的活性，來分析比較向土壤中單獨(dú)或者同時(shí)添加鎘、鋅后對蚯蚓纖維素酶活性的影響，得出以下結(jié)論：（1）無論土壤單

18、一鎘或鋅污染還是鎘、鋅復(fù)合污染，添加污染物的處理與對照相比，蚯蚓體內(nèi)纖維素酶活性都受到不同程度的抑制。在同一處理中，蚯蚓體內(nèi)的纖維素酶活性在不同處理時(shí)間也存在很大的差異。（2）土壤單一鎘污染培養(yǎng)試驗(yàn)前期，蚯蚓體內(nèi)纖維素酶活性隨著鎘質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而減少，表現(xiàn)為極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，中后期培養(yǎng)的線性相關(guān)性不明顯。土壤單一鋅污染試驗(yàn)的情況與鎘相似。之后，由于蚯蚓對污染物產(chǎn)生一定的抗性，污染物對蚯蚓纖維素酶活性的抑制不再隨質(zhì)量分?jǐn)?shù)產(chǎn)生顯著變化，到末期趨于平緩。添加劑量和所產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)比較表明，土壤中鎘對于蚯蚓體內(nèi)纖維素酶活性的毒性強(qiáng)于鋅。（3）土壤鎘、鋅兩種物質(zhì)復(fù)合污染情況下，除個(gè)別處理在某一天聯(lián)合效

19、應(yīng)表現(xiàn)為協(xié)同作用或加和作用外，其他測定結(jié)果均表現(xiàn)為拮抗作用，且其主要機(jī)制為受體拮抗。就二者對蚯蚓體內(nèi)纖維素酶活性的抑制程度而言，鎘也略強(qiáng)于鋅。由于農(nóng)業(yè)環(huán)境污染的復(fù)雜性9及土壤環(huán)境自身的復(fù)雜性使得添加劑量與酶活性之間的變化也很復(fù)雜，變化機(jī)理值得今后作深入研究。參考文獻(xiàn)：1 CHENG S. Heavy metal pollution in China: origin, pattern and control J. Environ Sci Pollute R, 2003, 10: 192-198.2 楊倩，付慶靈，胡紅青，等. 黃棕壤中鉛鎘復(fù)合污染萵苣生長和品質(zhì)的影響J. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，200

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26、 of agricultural Resource and Environment of Liaoning Province, Shenyang 110161, ChinaAbstract: Earthworms play an important part in transformation of soil nutrient cycling. Combined pollution caused by metals such as (Cd and Zn) is one of the important environmental pollution forms in soil. In order to determine the effects of combined pollution caused by Cd and Zn on earthworms, acute toxicological effects of single and combined Cd and Zn