紫外-可見分光光度法

1、紫外-可見分光光度法1 簡述紫外-可見分光光度法是在190-800nm波長范圍內(nèi)測定物質(zhì)的吸光度，用于鑒別、雜質(zhì)檢查和含量測定的方法。定量分析通常選擇物質(zhì)的最大吸收波長處測出吸光度，然后用對照品或吸收系數(shù)求算出被測物質(zhì)的含量，多用于制劑的含量測定；對已知物質(zhì)定性可用吸收峰波長或吸光度比值作為鑒別方法；若該物質(zhì)本身在紫外光區(qū)無吸收，而其雜質(zhì)在紫外光區(qū)有相當(dāng)強(qiáng)度的吸收，或雜質(zhì)的吸收峰處該物質(zhì)無吸收，則可用本法作雜質(zhì)檢查。物質(zhì)對紫外輻射的吸收是由于分子中原子的外層電子躍遷所產(chǎn)生，因此，紫外吸收主要決定于分子的電子結(jié)構(gòu)，故紫外光譜又稱電子光譜。有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)中如含有共軛體系、芳香環(huán)等發(fā)色基團(tuán)，均可

2、在紫外區(qū)（200400nm）或可見光區(qū)（400850nm）產(chǎn)生吸收。通常使用的紫外-可見分光光度計的工作波長范圍為190900nm。紫外吸收光譜為物質(zhì)對紫外區(qū)輻射的能量吸收圖。朗伯-比爾（Lambert-Beer）定律為光的吸收定律，它是紫外-可見分光光度法定量分析的依據(jù)，其數(shù)學(xué)表達(dá)式為:A=log=ECL式中 A為吸光度;T為透光率;E為吸收系數(shù);C為溶液濃度;L為光路長度。如溶液的濃度（C）為1%（g/ml），光路長度（L）為lcm，相應(yīng)的吸光度即為吸收系數(shù)以表示。如溶液的濃度（C）為摩爾濃度（mol/L），光路長度為lcm時，則相應(yīng)有吸收系數(shù)為摩爾吸收系數(shù)，以表示。2 儀器紫外-可見分光

3、光度計主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、記錄儀、顯示系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等部分組成。為了滿足紫外-可見光區(qū)全波長范圍的測定，儀器備有二種光源，即氘燈和碘鎢燈，前者用于紫外區(qū)，后者用于可見光區(qū)。單色器通常由進(jìn)光狹縫、出光狹縫、平行光裝置、色散元件，聚焦透鏡或反射鏡等組成。色散元件有棱鏡和光柵二種，棱鏡多用天然石英或熔融硅石制成，對20040Onm波長光的色散能力很強(qiáng)，對600nm以上波長的光色散能力較差，棱鏡色散所得的光譜為非勻排光譜。光柵系將反射或透射光經(jīng)衍射而達(dá)到色散作用，故常稱為衍射光柵，光柵光譜是按波長作線性排列，故為勻排光譜，雙光束儀器多用光柵為色散元件。檢測器有光電管和光電倍增管二種

4、。紫外-可見分光光度計依據(jù)其結(jié)構(gòu)和測量操作方式的不同可分為單光束和雙光束分光光 度計二類。單光束分光光度計有些仍為手工操作，即固定在某一波長，分別測量比較空白、樣品或參比的透光率或吸收度，操作比較費(fèi)時，用于繪制吸收光譜圖時很不方便，但適用于單波長的含量測定。雙光束分光光度計藉扇形鏡交替切換光路使分成樣品（S）和參比（R）兩光束，并先后到達(dá)檢測器，檢測器信號經(jīng)調(diào)制分離成兩光路對應(yīng)信號，信號的比值可直接用記錄儀記錄，雙光束分光光度計操作簡單，測量快速，自動化程度高，但作含量測定時，為求準(zhǔn)確起見，仍宜用固定波長測量方式。3 紫外-可見分光光度計的檢定3.1 波長準(zhǔn)確度波長準(zhǔn)確度的允差范圍 紫外-可見

5、分光光度計波長準(zhǔn)確度允許誤差，紫外區(qū)為 ±1.0nm，500nm處±2.0nm，700nm處±4.8nm。波長準(zhǔn)確度檢定方法用低壓汞燈檢定 關(guān)閉儀器光源，將汞燈（用筆式汞燈最方便）直接對準(zhǔn)進(jìn)光狹 縫，如為雙光束儀器，用單光束能量測定方式，采用波長掃描方式，掃描速度“慢”（如l5nm/min）、響應(yīng)“快”、最小狹縫寬度（如0.lnm）、量程0100%，在200800nm范圍內(nèi)單方向重復(fù)掃描3次，由儀器識別記錄各峰值（若儀器無“峰檢測”功能，必要時可對指定波長進(jìn)行“單峰”掃描）。單光束儀器以751G型為例，可將選擇開關(guān)放在×0.1位置，透光率讀數(shù)放在100（

6、或選擇開關(guān)放在×l，透光率放在10），關(guān)小狹縫，打開光閘門，緩緩轉(zhuǎn)動波長盤，尋找汞燈546.07nm峰出現(xiàn)的位置，若與波長讀數(shù)不符，應(yīng)調(diào)節(jié)儀器左側(cè)準(zhǔn)直鏡的波長調(diào)整螺絲，如波長向短波長方向移動，應(yīng)順時針方向旋轉(zhuǎn)波長調(diào)整螺絲，如向長波方向移動，則應(yīng)反時針方向旋轉(zhuǎn)波長調(diào)整螺絲，調(diào)整好后，再按汞燈的下列譜線測試，記錄每條譜線與儀器波長讀數(shù)的誤差。用于檢定紫外-可見分光光度計的汞燈譜線波長：237.83、253.65、275.28、2g6.73、302.15、313.16、334.15、365.02、365.48、366.33、404.66（紫色）、435.83（藍(lán)色）、546.07（綠色）、

7、576.96（黃色）及579.07nm。用儀器固有的氘燈檢定 本法主要用于日常工作中波長準(zhǔn)確度的核對。取單光束能量測定方式，測量條件同上述低壓汞燈的方法，對486.02及656.10nm二單峰進(jìn)行單方向重復(fù)掃描3次。用氧化鈥玻璃檢定 將氧化鈥玻璃放大樣品光路，參比光路為空氣，按測定吸收光譜圖方法測定。校正自動記錄儀器時，應(yīng)考慮記錄儀的時間常數(shù)，測定樣品與校正時取同一掃描速度。氧化鈥玻璃在27g.4、287.5、333.7、360.g、418.7、460.0、484.5、536.2及637.5nm波長處有尖銳的吸收峰，可供波長檢定用。氧化鈥玻璃因制造的原因，每片氧化鈥的吸收峰波長有差異，另外，在

8、放置過程中也會發(fā)生波長漂移，因此需定期由計量部門校驗(yàn)。用高氯酸鈥溶液檢定 本法可供沒有單光束測定功能的雙光束紫外分光光度計波長準(zhǔn)確度檢定用。高氯酸鈥溶液的配制方法:取10姑高氯酸為溶劑，加入氧化鈥（Ho203）配成4%溶液即得。高氯酸鈥溶液較強(qiáng)的吸收峰波長為241.13、278.10、287.18、333.44、345.47、361.31、416.28、451.30、485.29、536.64、640.52nm。如果是雙光束掃描儀器，但不是數(shù)據(jù)貯存型的（指是直接將信號描記于記錄紙上），記錄的波長可能因記錄筆滯后而非真實(shí)波長，為了準(zhǔn)確測定，建議采用定點(diǎn)檢定而不用掃描方式。3.2 吸光度準(zhǔn)確度 精

9、密稱取在120干燥至恒重的基準(zhǔn)重鉻酸鉀約60mg，置1000m1量瓶中，用0.005mol/L硫酸液溶解并稀釋至1000ml，用配對的lcm石英池，以0.005mol/L硫酸液為空白，在235，257，313，350nm分別測定吸光度，然后換算成，測得值應(yīng)符合下表中規(guī)定的允差范圍。分光光度法允差范圍波長（nm）吸收強(qiáng)度吸收系數(shù)（）允差范圍235257313350最小最大最小最大124.5144.0 48.62106.6123.0126.0142.8146.247.050.3105.5108.5分辨率、雜散光、基線平直度、穩(wěn)定度、絕緣電阻等項(xiàng)檢定，按國家技術(shù)監(jiān)督局“雙光束紫外-可見分光光度計檢定

10、規(guī)程”JJG682-90，并應(yīng)符合有關(guān)項(xiàng)下的規(guī)度。應(yīng)根據(jù)日常使用中，對以上兩項(xiàng)，即波長和吸光度準(zhǔn)確需要隨時檢查。4 樣品測定操作方法4.1 吸收系數(shù)測定（性狀項(xiàng)下）按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法配制供試品溶液，在規(guī)定的波長（參見5.8項(xiàng)）測定其吸光度，并計算吸收系數(shù)，應(yīng)符合規(guī)定范圍。4.2 鑒別及檢查 按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，測定供試品溶液的最大及最小吸收波長，有的并須測定其在最大吸收波長與最小吸收波長處的吸光度比值，均應(yīng)符合規(guī)定。4.3 含量測定采用吸收系數(shù)法應(yīng)對儀器進(jìn)行校正后測定，如為測定新品種的吸收系數(shù)，需按后列“吸收系數(shù)測定法”的規(guī)定進(jìn)行。5 注意事項(xiàng)5.1 試驗(yàn)中所用的量瓶和移液管均應(yīng)經(jīng)檢定校正

11、、洗凈后使用。5.2 使用的石英吸收池必須潔凈。當(dāng)吸收池中裝入同一溶劑，在規(guī)定波長測定各吸收池的透光率，如透光率相差在0.3%以下者可配對使用，否則必須加以校正。5.3 取吸收池時，手指拿毛玻璃面的兩側(cè)。裝樣品溶液的體積以池體積的4/5為度，使用揮發(fā)性溶液時應(yīng)加蓋，透光面要用擦鏡紙由上而下擦拭干凈，檢視應(yīng)無殘留溶劑，為防止溶劑揮發(fā)后溶質(zhì)殘留在池子的透光面，可先用蘸有空白溶劑的擦鏡紙擦拭，然后再用干擦鏡紙拭凈。吸收池放入樣品室時應(yīng)注意每次放入方向相同。使用后用溶劑及水沖洗干凈，晾干防塵保存，吸收池如污染不易洗凈時可用硫酸發(fā)煙硝酸（3:1v/v）混合液稍加浸泡后，洗凈備用。如用鉻酸鉀清潔液清洗時，

12、吸收池不宜在清潔液中長時間浸泡，否則清潔液中的鉻酸鉀結(jié)晶會損壞吸收池的光學(xué)表面，并應(yīng)充分用水沖洗，以防鉻酸鉀吸附于吸收池表面。5.4 測定前應(yīng)先檢查所用的溶劑在測定供試品所用的波長附近是否符合要求，可用lcm石英吸收池盛溶劑以空氣為空白（即參比光路中不放置任何物質(zhì)）測定其吸光度，應(yīng)符合下表規(guī)定，并不得在溶劑的截止使用波長以下測定。以空氣為空白測定溶劑在不同波長處的吸光度的規(guī)定波長范圍（nm） 220240241250251300300以上吸光度<0.4<0.2<0.1<0.05每次測定時應(yīng)采用同一廠牌批號，混合均勻的同批溶劑。5.5 稱量應(yīng)按藥典規(guī)定要求。配制測定溶液時

13、稀釋轉(zhuǎn)移次數(shù)應(yīng)盡可能少，轉(zhuǎn)移稀釋時所取容積一般應(yīng)不少于5ml。含量測定時供試品應(yīng)稱取2份，如為對照品比較法，對照品一般也應(yīng)稱取2份。吸收系數(shù)檢查也應(yīng)稱取供試品2份，平行操作，每份結(jié)果對平均值的偏差應(yīng)在±0.5%以內(nèi)。作鑒別或檢查可取樣品1份。5.6 供試品溶液的濃度，除各品種項(xiàng)下已有注明者外，供試品溶液的吸光度以在0.30.7之間為宜，吸光度讀數(shù)在此范圍誤差較小，并應(yīng)結(jié)合所用儀器吸光度線性范圍，配制合適的讀數(shù)濃度。5.7 選用儀器的狹縫譜帶寬度應(yīng)小于供試品吸收帶半高寬的10%，否則測得的吸光度值會偏低，或以減小狹縫寬度時供試品溶液的吸光度不再增加為準(zhǔn)，對于中國藥典紫外測定的大部分品種

14、，可以使用2nm縫寬，但當(dāng)吸收帶的半高寬小于2Onm時，則應(yīng)使用較窄的狹縫，例如青霉素鉀及鈉的吸光度檢查需用lnm縫寬或更窄，否則其264nm的吸光度會偏低。5.8 測定時除另有規(guī)定者外，應(yīng)在規(guī)定的吸收峰±2nm處，再測幾點(diǎn)的吸光度，以核對供試品的吸收峰位置是否正確，并以吸光度最大的波長作為測定波長，除另有規(guī)定外吸光度最大波長應(yīng)在該品種項(xiàng)下規(guī)定的波長±2nm以內(nèi)，否則應(yīng)考慮試樣的同一性、純度以及儀器波長的準(zhǔn)確度。5.9 用于制劑含量測定時，應(yīng)注意供試液與對照液的pH值是否一致，如pH值對吸收有影響，則應(yīng)調(diào)溶液的pH值一致后再測定吸光度。6 結(jié)果計算6.1 對照品比較法 可根

15、據(jù)供試品溶液及對照品溶液的吸光度與對照品溶液的濃度以正比法算出供試品溶液的濃度，再計算含量。C樣品=A樣品×C對照/A對照式中 A為吸光度值;C為測試液濃度（以mg/ml計）。6.2 吸收系數(shù)法 中國藥典規(guī)定的吸收系數(shù)，系指，即在指定波長時，光路長度為lcm，試樣濃度換算為1%（g/ml）時的吸光度值，故應(yīng)先求被測樣品的值，再與規(guī)定的值比較，可計算出供試樣品的含量。 （樣品） = 式中 A為供試品溶液測得的吸光度值;C為供試品溶液的百分濃度，即100ml中所含溶質(zhì)的克數(shù)（g/ml）;L為吸收池的光路長度（cm）。供試品的含量%= ×100式中 （樣品）為根據(jù)前式計算出的供試

16、品吸收系數(shù);（標(biāo)準(zhǔn)）為藥典或藥品標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的吸收系數(shù)。7 吸收系數(shù)測定法本法主要用于新品種的吸收系數(shù)測定。7.1 測定方法 取精制樣品精密稱取一定量，使樣品溶液配成吸光度讀數(shù)在0.60.8之間，置lm吸收池中，在規(guī)定波長處按5.8項(xiàng)的規(guī)定測出吸光度讀數(shù)，然后再用同批溶劑將溶液稀釋1倍，使吸光度在0.30.4之間，再按上述方法測定。樣品應(yīng)同時測定2份，同一臺儀器測定的2份結(jié)果，對平均值的偏差應(yīng)不超過±0.3%，否則應(yīng)重新測定。測定時，先按儀器正常靈敏度測試，然后再減小狹縫測定，直到減小狹縫吸光值不增加為止，取吸光度不改變的數(shù)據(jù)。再用4臺不同型號的儀器復(fù)測。吸收系數(shù)可根據(jù)朗伯-比爾定律求算，以下例說明:已知某化合物的分子量為287，用乙醇配成濃度為0.0030%的溶液，在波長297nm處，用lCm石英池，測得吸光度為0.613g，求值及摩爾吸收系數(shù)值。297nm=A/CL=205297nm