蛋白質(zhì)芯片技術(shù)及生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

1、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)及生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用摘要蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是一種新型蛋白質(zhì)分析技術(shù)，基于1995年所提出的光學(xué)生物傳感器的概念，可以在很小的表面積上，通過(guò)表面格式化和表面改性，以陣列式集成多種蛋白質(zhì)活性，利用生物分子的特異結(jié)合性和高分辨的光學(xué)成像相結(jié)合，僅需微量生理或生物采樣，即可以同時(shí)檢測(cè)、識(shí)別和純化不同的生物分子和研究分子間的相互作用。無(wú)需預(yù)處理和樣品標(biāo)記，可以直接測(cè)量像血漿、尿、唾液、淋巴液和細(xì)胞裂解液等生理樣品。它的高空間分辨率和高通量的特點(diǎn)，可以同時(shí)完成多元分析物或多樣本的重復(fù)性分析，具有快速和高復(fù)現(xiàn)的特點(diǎn)。此芯片技術(shù)可用于快速、原位的蛋白質(zhì)醫(yī)學(xué)診斷，藥物篩選和蛋白質(zhì)功能分析。關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)芯片

2、、蛋白質(zhì)分析、橢偏成像、表面改性一、 蛋白質(zhì)芯片的目的和意義 生物芯片技術(shù)具有并行、快速和自動(dòng)化分析的特點(diǎn)，和廣泛的應(yīng)用前景，成為二十一世紀(jì)生物醫(yī)學(xué)工程的研究熱點(diǎn)。生物芯片技術(shù)包括：基因芯片即DNA芯片、蛋白質(zhì)芯片或叫做生物分子芯片、細(xì)胞芯片和組織芯片，以及藥物芯片、生物電子芯片、仿神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等技術(shù)。蛋白質(zhì)是構(gòu)成生命體的最小活性單位，按目前的認(rèn)識(shí)，人體中存在著十萬(wàn)種以上的蛋白質(zhì)，在肌體中各盡職守，功能各異。隨著人類對(duì)于蛋白質(zhì)的認(rèn)識(shí)，對(duì)于了解人體的健康狀況，診斷和治療，越來(lái)越多地需要識(shí)別和檢測(cè)蛋白質(zhì)，并認(rèn)識(shí)其生理功能，這是非常艱巨和繁重的工作。蛋白質(zhì)的組成具有多樣性和可變性，蛋白質(zhì)的表達(dá)受著多種因

3、素的調(diào)控，在生命發(fā)育不同階段的蛋白質(zhì)的種類和構(gòu)成是不一樣的，不同的組織中細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)也有很大的差異，在病理或治療過(guò)程中，細(xì)胞蛋白質(zhì)的組成及其變化與正常過(guò)程中的也不同，因此，蛋白質(zhì)研究是在一個(gè)更加深入、和更貼近生命本質(zhì)的層面上去探討和發(fā)現(xiàn)生命活動(dòng)的規(guī)律和揭示重要生理、病理現(xiàn)象的本質(zhì)。光學(xué)蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)是探測(cè)和研究蛋白質(zhì)的新技術(shù)。此方法將高分辨率的光學(xué)顯微成像技術(shù)和集成化多元蛋白質(zhì)芯片技術(shù)相結(jié)合，形成了新型的并行、快速生物分子識(shí)別和檢測(cè)技術(shù)。它不需要任何添加劑，對(duì)生物活性無(wú)影響，還可以檢測(cè)生物分子反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù),從而獲得很多傳統(tǒng)技術(shù)所難以提供的信息，而且還可以廣泛地用于生物醫(yī)學(xué)研究、健康預(yù)測(cè)

4、、臨床診斷、新藥篩選和鑒定以及生物工業(yè)流程中的活性監(jiān)測(cè)等。二、 蛋白質(zhì)芯片研究的主要內(nèi)容及研制過(guò)程概括地講，蛋白質(zhì)芯片技術(shù)主要包括五部分內(nèi)容：1)芯片設(shè)計(jì)；2)配基裝配；3)芯片反應(yīng)器；4)芯片信號(hào)采樣和處理；5)芯片數(shù)據(jù)庫(kù)。蛋白質(zhì)芯片是一種蘊(yùn)含多學(xué)科知識(shí)的系統(tǒng)工程，為蛋白質(zhì)分析和檢測(cè)提供新型技術(shù)平臺(tái)。它不僅僅局限于蛋白質(zhì)檢測(cè)，還可以用于蛋白質(zhì)識(shí)別，特意位點(diǎn)研究、藥物篩選，以至蛋白純化等。根據(jù)用途，進(jìn)行蛋白質(zhì)芯片的設(shè)計(jì)。以疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的檢測(cè)為例，在診斷乙型肝炎時(shí)，國(guó)際公認(rèn)的檢測(cè)指標(biāo)為五項(xiàng)（HBsAg乙肝表面抗原，anti-HBsAg乙肝表面抗原抗體，HBeAg乙肝e抗原，anti- HBeA

5、g乙肝e抗原抗體和anti-HBcAg乙肝核心抗原抗體），通常需要在醫(yī)院的化驗(yàn)室里經(jīng)過(guò)兩天到一周的時(shí)間，用常規(guī)免疫檢測(cè)的方法逐項(xiàng)進(jìn)行。如果采用蛋白質(zhì)芯片來(lái)檢測(cè)，可以在一片乙肝診斷芯片上裝配檢測(cè)該五項(xiàng)的配體，即可在30分鐘內(nèi)同時(shí)完成五項(xiàng)檢測(cè)。在檢測(cè)對(duì)象確定以后，芯片設(shè)計(jì)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)就是確立特異性生物學(xué)系統(tǒng)，即具有生物特異結(jié)合性的分子對(duì)或分子組合，如：配體受體；蛋白蛋白；抗原抗體；病毒受體，等等；并優(yōu)選配基。以此為基礎(chǔ)實(shí)現(xiàn)配基和待測(cè)生物分子在芯片表面上的特異性復(fù)合。隨著分子生物學(xué)和生物化學(xué)的發(fā)展，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到生物分子是一些空間結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜的有機(jī)大分子，而生物活性則僅僅表現(xiàn)在某些特定位點(diǎn)上。配基

6、的使用實(shí)際上是配基分子上活性位點(diǎn)的利用。蛋白質(zhì)芯片是由多個(gè)表面生物探針組合而成，配基固定于表面上。通常由于生物分子與芯片基底表面的相互作用，會(huì)造成生物分子在表面的變形和變性，使生物活性減弱甚至消失。為了充分保持配基在芯片表面上的生物活性，需要設(shè)計(jì)芯片表面的蛋白質(zhì)活性裝配，將涉及基底的選擇，生物相容性、表明化學(xué)性質(zhì)、光學(xué)特性。為此進(jìn)行表面改性，包括物理、化學(xué)、生物化學(xué)及其組合表面改性，以適合配基的裝配。為了獲得高靈敏的檢測(cè)，配基的來(lái)源、裝配點(diǎn)、活性位點(diǎn)、表面位阻、非特意性阻隔、特異活性維持等諸問(wèn)題，都需要統(tǒng)籌考慮和解決。一個(gè)典型的蛋白質(zhì)檢測(cè)芯片是一個(gè)組合多種生物活性探針的微小表面，表面積可以從平

7、方毫米到平方厘米量級(jí)，視需要而定。當(dāng)檢測(cè)時(shí)，活性表面要與待測(cè)的生物分子溶液接觸，即需要芯片反應(yīng)器。分子表面相互作用、分子間相互作用、多面元獨(dú)立處理和樣品檢測(cè)的串、并行、反應(yīng)條件、結(jié)合速率、試劑用量、清洗、均一性等問(wèn)題將在微小的芯片反應(yīng)器中得到體現(xiàn)。在芯片的不同區(qū)域內(nèi)，所裝配的各種配體與待測(cè)溶液中所對(duì)應(yīng)的生物分子發(fā)生特異性結(jié)合，生成生物分子復(fù)合物，就會(huì)改變芯片表面的形貌。此變化可以通過(guò)芯片檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)獲得芯片數(shù)據(jù)的采集和處理。此芯片檢測(cè)系統(tǒng)是一種具有高空間分辯率的光機(jī)電組合的非接觸型光學(xué)顯微成像系統(tǒng)，它的控制、設(shè)置、調(diào)試、穩(wěn)定性、噪聲、時(shí)空分辯率、均一性、校對(duì)、信號(hào)采集、多元信息處理以及人機(jī)對(duì)話等

8、均由計(jì)算機(jī)自動(dòng)化操控。由于蛋白質(zhì)的種類繁多，僅人體內(nèi)就超過(guò)十萬(wàn)種，蛋白質(zhì)芯片數(shù)據(jù)庫(kù)將為用戶提供：蛋白質(zhì)種類、配基，試驗(yàn)條件，定、動(dòng)態(tài)檢測(cè)結(jié)果等參考和各種應(yīng)用的積累結(jié)果。1998年11月，該實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)通過(guò)中國(guó)科學(xué)院專家組的鑒定和驗(yàn)收，認(rèn)為其性能指標(biāo)達(dá)到國(guó)際領(lǐng)先水平。三、蛋白質(zhì)芯片的特點(diǎn)（1） 直接測(cè)量非純化分析物在進(jìn)行生物分子的特異性結(jié)合研究時(shí)，可以直接測(cè)量非純化分析物。（2） 多元樣品同時(shí)檢測(cè)由于觀測(cè)的樣品面積大，所以能夠用于多元樣品觀察，在同一表面上可以同時(shí)觀察幾個(gè)、幾十個(gè)、上百個(gè)以至更多樣品單元。此技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)體液中的多種蛋白質(zhì)，可以同時(shí)測(cè)量多對(duì)生物分子：包括蛋白質(zhì)、核酸、多糖、磷脂、

9、甚至生物小分子，以及侯選藥物的分子間相互作用的情況。它提供了同時(shí)分析多元分子溶液綜合信息和多樣品檢測(cè)的技術(shù)手段。（3） 樣品用量少采用了可以達(dá)到次單分子膜層分辨能力的光學(xué)成像技術(shù)和集成蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，樣品用量?jī)H在10微升量級(jí)。（4） 樣品無(wú)需任何標(biāo)記物直接測(cè)量生物分子的特異性結(jié)合所形成的生物分子復(fù)合物，并不需要象酶聯(lián)免疫或放射免疫法那樣對(duì)生物分子作標(biāo)記，不會(huì)對(duì)待測(cè)生物分子活性造成任何擾動(dòng)和損傷。（5） 實(shí)時(shí)檢測(cè)生物分子相互作用的動(dòng)態(tài)過(guò)程 可以實(shí)時(shí)測(cè)量多對(duì)生物分子的分子間相互作用過(guò)程，如分子間是否存在特異性結(jié)合、結(jié)合的強(qiáng)度和速度、解離的快慢以及結(jié)合部位的分析，可以獲得生物分子反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)信息。（

10、6） 具有分辨和排除干擾信號(hào)能力面陣式芯片測(cè)量具有分辨和排除干擾信號(hào)能力。（7） 檢測(cè)速度快電子圖像采樣具有快速攝取圖像的能力，為生物分子動(dòng)力學(xué)研究提供了可能。（8） 結(jié)果直觀檢測(cè)結(jié)果均以數(shù)字圖像形式輸出，可以進(jìn)行定性和定量測(cè)量。四、 生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用及發(fā)展前景利用蛋白質(zhì)芯片已經(jīng)開(kāi)展了一些生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。如：乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)；研究了配體和受體的特異結(jié)合(白介素 6)；進(jìn)行了內(nèi)分泌激素的測(cè)定嘗試；實(shí)驗(yàn)多種抗原-抗體相互作用研究；鑒定治療肝癌的單克隆抗體藥物，其中所測(cè)量的肝癌細(xì)胞裂解液成分復(fù)雜，是其它免疫學(xué)方法所不能測(cè)量的；以及病毒檢測(cè)，蛋白質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)吸附和細(xì)胞黏附的研究等。單克隆抗體藥物與肝癌細(xì)胞

11、裂解液反應(yīng)形成的復(fù)合膜層單克隆抗體藥物膜層芯片基底圖1. 鑒定治療肝癌的單克隆抗體藥物。單克隆抗體藥物與肝癌細(xì)胞裂解液有明顯的陽(yáng)性反應(yīng)。AB圖2. 蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)乙型肝炎表面抗原。同時(shí)在A 、B兩點(diǎn)上固定單克隆抗體后，A點(diǎn)同陰性血清反應(yīng)，B點(diǎn)同含有1ng/ml的乙型肝炎表面抗原的血清反應(yīng)30分鐘。同A點(diǎn)相比，B點(diǎn)出現(xiàn)明顯的抗原抗體復(fù)合膜層。IgG/antiIgGBSAFib/antiFib基底IgGHSABSAFib基底(A)HSA/antiHSA圖3. 多元蛋白質(zhì)芯片同時(shí)檢測(cè)多種生物分子。（A）多元蛋白質(zhì)芯片上同時(shí)固定了牛血清白蛋白（BSA）、人免疫球蛋白G（IgG）、人血纖維蛋白原（Fib）和人血清白蛋白（HSA）。（B）蛋白質(zhì)芯片與含有人免疫球蛋白G（IgG）、人血纖維蛋白原（Fib）和人血清白蛋白（HSA）抗體的血清反應(yīng)后，生成了相應(yīng)的抗原抗體復(fù)合膜層。牛血清白蛋白（BSA）膜層厚度沒(méi)有增長(zhǎng)，因血清中無(wú)牛血清白蛋白抗體存在。 此成果為醫(yī)學(xué)診斷、藥物篩選和分子生物學(xué)的研究和發(fā)展，開(kāi)辟了新的途徑。由此獲得其它方法無(wú)法提供的信息，為一些尚無(wú)答案的生物醫(yī)學(xué)理論問(wèn)題提供解答。其主要應(yīng)用領(lǐng)域：（1） 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能研究；（2） 醫(yī)學(xué)診斷和醫(yī)療（3） 新藥開(kāi)發(fā)；（4） 生物工業(yè)等