酶制劑對(duì)營養(yǎng)吸收轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的調(diào)控

1、1前言酶制劑在飼料中添加的研究和應(yīng)用是目前生物技術(shù)在飼料工業(yè)中應(yīng)用最受關(guān)注的領(lǐng)域，許多研究表明飼用酶制劑，特別是非淀粉多糖酶能提高畜禽生產(chǎn)性能，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，非淀粉多糖酶可以提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化率，例如提高回腸氨基酸表觀消化率，而且腸系膜靜脈血清總氨基酸的含量顯著上升。但是，非淀粉多糖酶在提高腸道可利用氨基酸的同時(shí)，是否能提高氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因表達(dá)？這是飼用酶制劑發(fā)揮作用的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。Kaput等(2004)指出，日糧的化學(xué)組成可以直接或間接影響動(dòng)物的基因表達(dá)。動(dòng)物組織對(duì)于飼料成分以及營養(yǎng)水平變化的適應(yīng)性反應(yīng)在其對(duì)于這些營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的載體的類型和數(shù)量的變化(Humphrey等，2004

2、)。因此，開展添加飼用酶制劑對(duì)營養(yǎng)吸收轉(zhuǎn)運(yùn)載體的基因表達(dá)影響的研究，將開拓酶制劑研究的新領(lǐng)域-酶制劑的分子營養(yǎng)學(xué)。另外，飼用酶制劑的應(yīng)用，對(duì)傳統(tǒng)的動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)說提出了挑戰(zhàn)，如飼料配方、原料選擇和營養(yǎng)需要量等方面需要重新研究或修正。為此，馮定遠(yuǎn)和沈水寶（2005）提出了飼料酶制劑的新理念“加酶日糧ENIV系統(tǒng)的建立和應(yīng)用”，添加酶制劑時(shí)，飼料營養(yǎng)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫在原有的營養(yǎng)成分的基礎(chǔ)上，增加有效營養(yǎng)改進(jìn)值，使酶制劑提高有效營養(yǎng)供應(yīng)可以具體量化，可操作性更強(qiáng)。作為一種理論與實(shí)踐的新理念和思路的探討，是否有其基礎(chǔ)和依據(jù)？最近幾年，我們?cè)诿钢苿┑姆肿訝I養(yǎng)學(xué)這一方面進(jìn)行了一些初步的研究（譚會(huì)澤2006；譚會(huì)澤等

3、2007）。本文以飼用非淀粉多糖酶在小麥型日糧中的應(yīng)用，重點(diǎn)討論添加非淀粉多糖酶對(duì)氨基酸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)載體的mRNA表達(dá)的影響，并試圖分析我們提出的加酶日糧ENIV系統(tǒng)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。2非淀粉多糖酶對(duì)腸道氨基酸吸收的影響飼糧添加非淀粉多糖酶可以降低水溶性NSP所導(dǎo)致的食糜粘性，從而提高消化酶對(duì)底物的作用效率；還可作用于非可溶性NSP，破碎植物細(xì)胞壁，釋放出營養(yǎng)物質(zhì)；此外非淀粉多糖酶可以消除由于食糜粘性的增加而造成的腸道粘膜表面水層厚度增加。木聚糖酶的作用結(jié)果表現(xiàn)為提高了小麥型飼糧營養(yǎng)物質(zhì)的消化率，即提高了腸道食糜中可被吸收的營養(yǎng)物質(zhì)的量。高粘性的NSP可以使腸道粘膜細(xì)胞的分裂加速（Southon等

4、，1985），而木聚糖酶在小麥型肉雞飼糧中添加，可減少肉雞消化系統(tǒng)的代償性增生，改善腸道絨毛形態(tài)（于旭華，2004）。底物濃度的提高和消化道形態(tài)的改善有可能會(huì)影響到腸道上皮細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，因?yàn)樵诩?xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育和分化過程中，遺傳信息的表達(dá)隨著細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境條件的改變會(huì)加以調(diào)整，這就是適應(yīng)性調(diào)控（adaptiveregulation）。我們的研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，木聚糖酶提高顯著提高第三周的生產(chǎn)性能，提高了16日齡嶺南黃肉雞小麥型飼糧的回腸氨基酸表觀消化率，且腸系膜靜脈血清總氨基酸的含量顯著提高，對(duì)堿性氨基酸賴氨酸、精氨酸和組氨酸的含量都有較大幅度的提高。但是，木聚糖酶在提高肉雞腸道可利用

5、氨基酸的同時(shí)，是否還能上調(diào)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)。在細(xì)胞適應(yīng)性調(diào)控的過程中，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是關(guān)鍵，因此mRNA的表達(dá)豐度決定了動(dòng)物及細(xì)胞對(duì)內(nèi)外環(huán)境條件改變的適應(yīng)能力。特定mRNA是由細(xì)胞在應(yīng)答它所處的環(huán)境中合成的，細(xì)胞由此控制它所產(chǎn)生蛋白質(zhì)的種類和數(shù)量。mRNA表達(dá)的水平在一定程度上可以衡量其相關(guān)蛋白的表達(dá)量。對(duì)于飼糧因素影響腸道氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)的研究還未見報(bào)道。但是Humphrey等（2004)試驗(yàn)得出，動(dòng)物組織對(duì)于飼料成分以及營養(yǎng)水平變化的適應(yīng)性反應(yīng)主要表現(xiàn)在對(duì)于這些營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的載體的類型和數(shù)量的變化。通過體外培養(yǎng)人腸道上皮細(xì)胞試驗(yàn)得出：在營養(yǎng)缺乏的情況下，細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺和亮氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)降

6、低，降低了Vmas而不影響Km值，結(jié)果說明營養(yǎng)缺乏降低了細(xì)胞膜上活性轉(zhuǎn)運(yùn)載體的數(shù)量，而轉(zhuǎn)運(yùn)載體對(duì)谷氨酰和亮氨酸的親和力沒有改變。體外培養(yǎng)腸道上皮細(xì)胞（Caco-2細(xì)胞系），在營養(yǎng)缺乏的情況下（用磷酸鹽緩沖液培養(yǎng)），細(xì)胞ATB0mRNA的表達(dá)顯著降低(Wasa等,2004)。木聚糖酶可以消除木聚糖所造成的高粘性食糜，提高肉雞對(duì)小麥型飼糧氨基酸的消化率，對(duì)腸道發(fā)育也有一定的影響。于旭華（2004）研究表明，在小麥型飼糧中添加木聚糖酶，使肉雞小腸絨毛變短，而且絨毛頂端變細(xì)，木聚糖酶降低了小腸絨毛的代償性增生。由此可以推測(cè)木聚糖酶可能影響腸道粘膜細(xì)胞氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)量，從而增強(qiáng)粘膜細(xì)胞對(duì)氨基酸的吸

7、收。由于細(xì)胞對(duì)于內(nèi)外環(huán)境的變化可以作出適應(yīng)性調(diào)節(jié)，表現(xiàn)為相關(guān)基因表達(dá)的改變。研究粘膜細(xì)胞上氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)的變化，可以直接研究其在粘膜上的表達(dá)量，也可以研究其mRNA的表達(dá)豐度，一般認(rèn)為mRNA的表達(dá)豐度決定了動(dòng)物及細(xì)胞對(duì)內(nèi)外環(huán)境條件改變的適應(yīng)能力。3重要的腸道氨基酸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)載體系統(tǒng)近幾年來，關(guān)于細(xì)胞氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的研究取得了顯著的進(jìn)展，根據(jù)轉(zhuǎn)運(yùn)載體的底物特異性和動(dòng)力學(xué)特性，目前已經(jīng)鑒別確定的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)有15種以上，并且編碼這些轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)蛋白的部分cDNA已被克隆出來。2004年雞的基因組測(cè)序完成，相關(guān)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的mRNA序列被陸續(xù)公布，使得可以從基因水平來研究氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的

8、變化。粘膜細(xì)胞刷狀緣上的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體主要負(fù)責(zé)從腸腔中吸收各種氨基酸，而粘膜細(xì)胞基底膜上氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體則用來加速氨基酸在腸細(xì)胞和體內(nèi)循環(huán)間的轉(zhuǎn)移。如果腸腔中氨基酸的濃度低于上皮細(xì)胞或者相應(yīng)毛細(xì)管床中氨基酸的濃度，其吸收轉(zhuǎn)運(yùn)功能必須與其它的能量源（如例子濃度梯度、電勢(shì)等）相偶聯(lián)才能發(fā)揮(Devs,1998)。目前，腸道粘膜細(xì)胞刷狀緣頂端確定存在的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)有：Na+依賴型中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)B0(Munck和Munck,1999;Munck等,2000)，Na+依賴型中性和堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)B0,+(Munck,1995)，Na+和K+依賴型酸性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)XAG(Munck等,2000)，H+驅(qū)

9、動(dòng)脯氨酸和甘氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)IMINO(PAT)(Chen等,2003)，Na+依賴型中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)ASC(Munck和Munck,1999;Munck等,2000;Avissar等,2001)，非Na+依賴型中性和堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)b0,+(Palacin,1998;Munck等,2000;Torras-Llort等,2001)；腸道粘膜細(xì)胞基底膜部位確定存在的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)有：Na+依賴型中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)A和N(Wilde和Kilberg,1991)，Na+依賴型堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)y+L(Desjeux等,1980)，非Na+依賴型中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)asc和L(Lash和Jones,1984

10、;Wilde和Kilberg,1991)。腸道氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)數(shù)量多，其轉(zhuǎn)運(yùn)底物（20種氨基酸）相互重疊。腸道堿性氨基酸的吸收機(jī)制如下(Kanai等,2000;Danniel,2002;Verrey等,2004)：在腸道粘膜細(xì)胞的頂端，轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)b0,+發(fā)揮反向交換轉(zhuǎn)運(yùn)的功能，向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入堿性氨基酸和胱氨酸，同時(shí)交換出中性氨基酸。由于通常細(xì)胞內(nèi)電勢(shì)較低，以及在膜內(nèi)外轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)底物結(jié)合力的不同，促使堿性氨基酸（帶正電荷）向細(xì)胞內(nèi)聚集。轉(zhuǎn)運(yùn)出的中性氨基酸通過粘膜細(xì)胞頂端的Na+/氨基酸共轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（尤其是系統(tǒng)B0，）在Na+驅(qū)動(dòng)力作用下逆濃度梯度重吸收進(jìn)細(xì)胞，中性氨基酸的濃度梯度進(jìn)一步驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)b0,+反

11、向轉(zhuǎn)運(yùn)功能。在上皮細(xì)胞的基底部位，系統(tǒng)y+L在Na+離子濃度梯度的驅(qū)動(dòng)下，向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入中性氨基酸，同時(shí)轉(zhuǎn)出堿性氨基酸進(jìn)入血液循環(huán)。粘膜細(xì)胞中的中性氨基酸可通過系統(tǒng)L的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LAT1、LAT2以及其它轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)完成與血液間的交換。與系統(tǒng)b0,+和y+L不同，廣泛存在的y+系統(tǒng)為反向加速的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，主要功能是逆堿性氨基酸濃度梯度向細(xì)胞內(nèi)聚集堿性氨基酸(Stein,1990)。4非淀粉多糖酶對(duì)腸道氨基酸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)的影響因?yàn)槟揪厶敲竿ㄟ^消除木聚糖的粘性，可以提高腸道中可被利用氨基酸的濃度，同時(shí)改善腸道絨毛的形態(tài)（于旭華，2004），但是否還會(huì)影響氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)還沒有報(bào)道。華南農(nóng)業(yè)大

12、學(xué)最近研究添加木聚糖酶對(duì)腸道中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)的影響，根據(jù)生產(chǎn)性能、回腸氨基酸消化率和腸系膜靜脈血清氨基酸含量，發(fā)現(xiàn)木聚糖酶顯著提高了第三周的平均日增重（P0.05），顯著降低了料重比（P0.05），同時(shí)，對(duì)16日齡回腸食糜氨基酸表觀消化率有提高的趨勢(shì)，顯著提高了16日齡腸系膜靜脈血清氨基酸的濃度（P0.05），對(duì)血清堿性氨基酸均有大幅度提高，因此選取16日齡的試驗(yàn)肉雞，采集空腸和回腸組織樣，研究對(duì)照組和加酶日糧組堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)的差異。研究發(fā)現(xiàn)，小麥型飼糧添加木聚糖酶，可顯著提高嶺南黃肉雞空腸rBAT和CAT4mRNA的表達(dá)豐度，對(duì)空腸y+LAT2mRNA和CAT1m

13、RNA的表達(dá)也有提高的趨勢(shì)。對(duì)回腸rBATmRNA的表達(dá)沒有影響，對(duì)回腸y+LAT2、CAT1和CAT4mRNA的表達(dá)有提高的趨勢(shì)。結(jié)果表明，在嶺南黃肉雞小麥型飼糧中添加木聚糖酶可以上調(diào)空腸中部分堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA的表達(dá)豐度，從而提高腸粘膜細(xì)胞對(duì)氨基酸的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。木聚糖酶顯著提高了空腸刷狀緣上b0,+系統(tǒng)rBATmRNA的表達(dá)豐度，而對(duì)于基底部位的y+LAT2mRNA的表達(dá)沒有影響，說明木聚糖酶對(duì)腸腔面生理形態(tài)的影響較大（譚會(huì)澤，2006）。研究表明，在AA肉雞小麥型飼糧中添加木聚糖酶，可以上調(diào)位于刷狀緣的鈉/葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)載體1（SGLT1）mRNA在十二指腸的表達(dá)豐度，并推測(cè)木

14、聚糖酶可能通過影響內(nèi)分泌的變化來增加小腸上段SGLT1的數(shù)量。我們推測(cè)木聚糖酶對(duì)于腸道氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體也有類似的影響。在腸道上皮細(xì)胞的堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中，系統(tǒng)b0,+和系統(tǒng)y+L分別分布于上皮細(xì)胞的刷狀緣和基底部位，負(fù)責(zé)堿性氨基酸的吸收和轉(zhuǎn)出。系統(tǒng)y+主要功能可能是維持細(xì)胞內(nèi)堿性氨基酸正常代謝的水平，在腸道堿性氨基酸吸收中不起主要的功能（王修啟2003）。木聚糖對(duì)肉雞腸道葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)時(shí)也發(fā)現(xiàn)木聚糖酶只上調(diào)了位于刷狀緣的載體SGLT1mRNA的表達(dá)，而對(duì)于基底膜上的GLUT2mRNA的表達(dá)沒有顯著影響。木聚糖酶對(duì)于空腸系統(tǒng)y+的CAT4mRNA的表達(dá)也顯著提高，可能原因是CAT4主

15、要分布在粘膜細(xì)胞的刷狀緣，但還沒有直接的證據(jù)。木聚糖酶對(duì)于小腸遠(yuǎn)端堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)的影響沒有近端顯著，對(duì)于回腸rBATmRNA的表達(dá)沒有影響，對(duì)于回腸y+LAT2、CAT1和CAT4mRNA的表達(dá)有提高的趨勢(shì)。譚會(huì)澤（2006）的研究表明木聚糖酶可以上調(diào)飼喂小麥型飼糧嶺南黃肉雞空腸氨基酸轉(zhuǎn)載體rBAT和CAT4mRNA的表達(dá)，是對(duì)木聚糖酶提高氨基酸利用率機(jī)理的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，但是上調(diào)相關(guān)基因表達(dá)的機(jī)理（信號(hào)傳導(dǎo)通路）還不清楚。添加木聚糖酶對(duì)腸道中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)的影響，可能是由于細(xì)胞本身可以根據(jù)內(nèi)外環(huán)境的變化作出適應(yīng)性的條件，表現(xiàn)在對(duì)于營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的載體的類型和數(shù)量的變化

16、(Humphrey等,2004)。王修啟（2003）的研究表明，在AA肉雞小麥型飼糧中添加木聚糖酶，可以上調(diào)位于腸道刷狀緣的鈉/葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)載體1（SGLT1）mRNA在十二指腸的表達(dá)豐度，并推測(cè)木聚糖酶可能通過影響內(nèi)分泌的變化來增加小腸上段SGLT1的數(shù)量。譚會(huì)澤（2006）推測(cè)木聚糖酶對(duì)于腸道氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體也有類似的影響。5加酶日糧ENIV系統(tǒng)的分子營養(yǎng)學(xué)機(jī)理我們?cè)陲暳厦钢苿┑男吕砟睢凹用溉占ZENIV系統(tǒng)的建立和應(yīng)用”中，在總結(jié)不同研究者結(jié)果的基礎(chǔ)上，提出小麥在添加阿拉伯木聚糖酶時(shí)，蛋白質(zhì)利用的改善程度為9.518%.即蛋白質(zhì)ENIV值為1.32.5%；雞代謝能改善程度為4.0-6.3%，

17、即代謝能ENIV值為120-190kcal/kg（馮定遠(yuǎn)和沈水寶2005）。這一估計(jì)是否有其分子生物學(xué)基礎(chǔ)？因?yàn)檫@一估計(jì)是基于營養(yǎng)的消化率。但是，營養(yǎng)的消化不等于營養(yǎng)的吸收和利用，只有吸收才能真正有效。在我們最近的試驗(yàn)中，小麥型飼糧添加木聚糖酶，可顯著提高嶺南黃肉雞空腸rBAT和CAT4mRNA的表達(dá)豐度，對(duì)空腸y+LAT2mRNA和CAT1mRNA的表達(dá)也有提高的趨勢(shì)。對(duì)回腸y+LAT2、CAT1和CAT4mRNA的表達(dá)有提高的趨勢(shì)。在嶺南黃肉雞小麥型飼糧中添加木聚糖酶同時(shí)可以上調(diào)空腸中部分堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA的表達(dá)豐度，從而提高腸粘膜細(xì)胞對(duì)氨基酸的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。其中添加木聚糖酶對(duì)嶺南黃肉雞空腸和回腸y+LAT2mRNA表達(dá)的影響加酶組空腸y+LAT2mRNA的表達(dá)豐度比對(duì)照組提高了20.77。加酶組回腸y+LAT2mRNA的表達(dá)豐度比對(duì)照組提高了17.6。添加木聚糖酶對(duì)嶺南黃肉雞空腸和十二指腸CAT1mRNA表達(dá)的影響加酶組空腸CAT1mRNA的表達(dá)豐度高于對(duì)照組12.58。加酶組回腸CAT1mRNA的表達(dá)豐度高于對(duì)照組17.56。添加木聚糖酶對(duì)嶺南黃肉雞空腸和回腸CAT4mRNA