畢赤酵母翻譯

1、Glycoengineered(糖基化工程 畢赤 pastoris(畢赤酵母 中表達的重組單克隆抗體的純化工藝開發(fā)摘要一個強健的和可擴展的凈化過程被開發(fā)快速從 glycoengineered 畢赤酵母發(fā)酵生成抗體的純度高、數量充足。蛋白 A 親和層析用于捕獲從發(fā)酵液抗體。PH 梯度洗脫已應用到要防止抗體沉淀在低 pH 的蛋白 A 列。從蛋白抗體色譜法所載一些產品的相關雜質,被劈重鏈、重鏈和輕鏈的 misassembling。它也有一些處理相關的雜質,包括蛋白 A 殘留、 endotoxin(內毒素、宿主細胞 DNA 和蛋白質。Ph 值為 4.5-6.0 的最優(yōu)氯化鈉漸變陽離子交換色譜法有效去除

2、這些產品和過程相關的雜質。從 glycoengineered P.酵母抗體是其 heterotetramer 折疊、物理穩(wěn)定性和約束力的親和性的商業(yè)同行相媲美。介紹單克隆抗體(Mab正迅速成為關鍵產品的生物醫(yī)藥產業(yè)。大多數商業(yè)治療性抗體是原封 IgG 分子與 IgG1、 IgG2 正在共同的子類。這些 IgGs 由調解抗原和效應器函數之間的聯系,在免疫過程中發(fā)揮中心作用。對目標細胞的特異性抗原的 igg 抗體可變域的綁定將抗體依賴的細胞毒作用 (ADCC 及補體依賴性細胞毒性 (CDC 定向殺害的目標單元格。ADCC 觸發(fā)由交聯體 Fc 域的 IgG 抗體(Fc(Rs,尤其是 Fc (RI 和

3、Fc (制證機對免疫效應細胞?？赡苷{解 ADCC 效應細胞包括自然殺手細胞、巨噬細胞和嗜中性粒細胞。疾病預防控制中心是由補充組件 C1q 綁定到 IgG,觸發(fā)蛋白水解的級聯,以激活補充 fc 功能區(qū)啟動。IgG 型抗體有兩重鏈和兩條輕鏈由分子內的二硫鍵形成 heterotetramer 在一起。重鏈是通過共價鍵固定在天冬酰胺 297 (Asn-297 低聚糖的糖基化。人免疫球蛋白的主要N-聚糖復雜 biantennary (二分支的 類型,有 '核心' heptasaccharide(七庚糖, GlcNac2Man3GlcNac2,被稱為 G0 在我們的工作和文學。其他的糖分殘

4、留可能會附加到 '核心 ' 要進一步生成復雜 biantennary 宇輝結構,如 GalGlcNac2Man3GlcNac2 (G1, Gal2GlcNac2Man3GlcNac2 (G2 Neu5Ac2Gal2GlcNac2Man3GlcNac2。目前,治療單克隆抗體是在哺乳動物細胞,主要是在中國倉鼠卵巢 (CHO 細胞株生產的。在哺乳動物細胞中生產的重組抗體的宇輝配置文件是主要是異類。非均質性可以變化廣泛克隆克隆,是取決于生產和文化條件的模式?？贵w宇輝配置文件可以有重大的影響 ADCC 和疾病預防控制中心。Deglycosylated IgG 顯示沒有激活 ADCC 和疾

5、病預防控制中心的能力。Rituximab(利妥昔單抗,嵌合的人權小鼠人性化抗 CD20 單克隆抗體,生產的 glycoengineered 畢赤酵母中有兩個較高親和力向 Fc (RIIIa 和更大B 細胞耗竭效價比從 CHO 細胞生產的對應。N-聚糖從治療單克隆抗體在哺乳動物細胞中生產主要是 fucosylated(巖藻糖基化,在這一個 fucose(巖藻糖 殘留物附加到主的N-乙酰氨基葡萄糖殘留。它表明聚糖 fucosylation 影響 ADCC 和疾病預防控制中心的功效。例如,關于人類 IgG1 afucosylated 聚糖可以顯著提高 IgG1 綁定到 Fc (制證機和增強 ADCC

6、 功效,但并不影響綁定到 Fc (RI 或 C1q。這些結果表明可能通過生成特定的抗體 glycoform 優(yōu)化抗體介導的效應的功能。酵母是一個廣泛使用的重組蛋白表達系統。但是,在野生型酵母生產的糖蛋白包含潛在免疫原性高甘露糖類型限制為治療蛋白和抗體生產的酵母表達系統使用的 N-聚糖。在酵母中的抗體表達的另一個挑戰(zhàn)是重型和輕型鏈要形成 heterotetramer 的程序集。一般情況下,在酵母表達分泌的抗體是黑腹為主或重型和輕型鏈的單體。此抗體大會問題可能與有關降低效率的抗體可折疊、加工和分泌的酵母有高甘露糖時鍵入 N-聚糖。人類糖基化的途徑是入酵母體育中執(zhí)行特定的人性化的 N-糖基化反應與高

7、保真設計出來。Glycoengineered 細胞株的 P.酵母中成功制造了重組蛋白和單克隆抗體與人性化的 N-連接糖結構。利妥昔單抗產生不同 glycoengineered 細胞株的 P.酵母中可以正確裝配形成 heterotetramer 和從 CHO 細胞展示商業(yè)利妥昔單抗相同抗原結合的特點。在哺乳動物細胞培養(yǎng)、蛋白 A 親和層析是廣泛用于純化的第一步直接捕獲單克隆抗體產品ph 值為中性。通常從蛋白A 列在低pH 洗脫的產品包含過程和產品相關的雜質。這一進程有關的雜質包括內毒素、浸的蛋白 A、宿主細胞蛋白質和 DNA。該產品相關的雜質主要是聚合和修剪單克隆抗體產品。若要刪除這些雜質,一般

8、采用第二和第三色譜的步驟,通常從色譜陽離子交換 (CEX、陰離子交換色譜法 (AEX、疏水層析(HIC、疏水性充電感應色譜 (信息中心 和羥基磷灰石色譜中選擇。在我們的研究從哺乳動物細胞培養(yǎng)的許多單克隆抗體純化過程不工作好刪除產品相關的雜質從 P.酵母發(fā)酵。我們以前用于蛋白 A 親和層析和 HIC 苯基瓊脂糖凝膠凈化從glycoengineered P.酵母中少量的利妥昔單抗。最近,規(guī)模較小,非優(yōu)化的版本,本文介紹的方法用來凈化小額從 glycoengineered P.酵母發(fā)酵的單克隆抗體。人性化的反-HER2/東大受體 IgG1 單克隆抗體作為示例用于研究單克隆抗體生產的glycoengi

9、neered P.酵母。一個強大且可擴展的分離純化過程是由優(yōu)化工藝條件為蛋白A 和陽離子交換產物開發(fā)的。這一進程有效去除產品的相關雜質和進程相關的殘余蛋白 A、宿主細胞 DNA 和內毒素的雜質?？说母叨燃儍艨?HER2 人與生物圈方案很容易被從 P.酵母發(fā)酵時支持生化特性和動物研究生成。從 glycoengineered P.酵母中抗HER2 人與生物圈是可比較的與其對應商業(yè) (曲妥珠單抗 在 heterotetramer 折疊式、物理穩(wěn)定性和親和力的抗原,Fc 制作的 CHO 細胞 (RI C1q。此外,抗 HER2 單克隆抗體生產和在體育中酵母本身就是 afucosylated。材料和方法

10、材料精簡蹄筋(80 粒子大小,MabSelect 肯定( 粒子大小、源 30 多歲(粒子大小、 GE 醫(yī)療集團 (熱身賽的獲得了Capto S (粒子大小、 SP 瓊脂糖凝膠高性能 (HP (粒子大小、SP 瓊脂糖凝膠快速流 (FF (45 粒子大小、 XK26/40、 XK16/40 和蓬亂 10/200 列、新澤西州、美國。波羅斯島 50 HS (m 粒子大小是從Perseptive 生物系統(美國馬薩諸塞州弗雷明漢。化學品是從JT 貝克(菲利普斯堡,新澤西州,美國或西格瑪奧爾德里奇 (圣路易斯,密蘇里州,美國。所有緩沖區(qū)被都篩選與 Nalgene 聚醚砜膜過濾器(孔隙大小(羅切斯特,紐約

11、州,美國。是從匠(哥廷根德國。矢量抗人 IgG-AlexaFluor488,pPICZA,PicoGreen 試劑和 4-甲基傘形酮磷酸 (4-MUP 是從Invitrogen (美國加利福尼亞州卡爾斯巴德。共軛鏈霉親和堿性磷酸酶 (AP 是從栽 (麥迪遜,無線,美國。4 20%招聘 HCl 準備好凝膠和 Prestained SDS 標準(廣泛范圍是從生物 Rad 實驗室 (大力神,加利福尼亞州,美國。Fc (RI 是從 R&D 系統(美國明尼蘇達明尼阿波利斯。人類 C1q 是從美國生物 (美國馬薩諸塞州斯旺普斯科特。從生物界 (美國馬薩諸塞州劍橋 是抗 C1q 多克隆抗體-AP 共

12、軛。根據前面所述的方法被建造單元格行和發(fā)酵抗HER2 人與生物圈P.酵母中表達細胞株。簡單地說,重型和輕型鏈基因被極量到 pPICZA 矢量,轉換為 glycoengineered GFI5.0 應變。單元格行是為人與生物圈方案表達效價和 N-糖基化配置文件轉化的菌株篩選后選定的。根據前面所述的方法進行了 15 和 40 L 生物反應器中的發(fā)酵。發(fā)酵液是由15,800 g 30 min 離心法恢復和由通過過濾澄清。柱層析法與 ÄKTA 資源管理器 100 系統從 GE 醫(yī)療集團(美國新澤西州熱身賽 在室溫下進行了所有色譜試驗。流率被選為有 5 分鐘的停留時間列,除非它具體表明。紫外線

13、吸收的蛋白質進行了監(jiān)測在 280 nm。A 蛋白親和層析,以確定蛋白結合能力為人與生物圈方案從 P.酵母發(fā)酵的色譜,精簡蹄筋 A MabSelect 確定列平衡 20 毫米招聘,ph 值 7.0 中五柱床體積 (CV 和被加載與發(fā)酵上清液,ph 值 7.0,要完全飽和的列綁定能力。隨后,列洗一次與 20 毫米招聘,ph 值 7.0,1 M 氯化鈉(3 CV 和弱酸線性梯度,降低 ph 值從 5.0 到 3.0 的100 毫米檸檬酸鈉或不 1 M 精氨酸 (10 CV。A280nm 高峰千里馬在 pH 測量從 ÄKTA 資源管理器 100 系統出水中。代表人與生物圈峰值的分數被匯集蛋白

14、濃度測定。蛋白 A 列綁定能力,(單克隆抗體每毫升樹脂的流動速度肯定會有 5 分鐘的列駐地時間量被從蛋白的洗脫分數按照下列公式計算:結合能力 = VE X CE / VR VE,卷的體統 (ml ;CE、蛋白濃度在體統分數(mg/ml;VR,蛋白 A 樹脂 (毫升 列中的容量。陽離子交換色譜法簡化蹄筋純凈的抗 HER2 人與生物圈用于陽離子交換色譜法發(fā)展。陽離子 exchangeresins 在蓬亂 10/200 (1 厘米身份× 19 厘米平衡與 ph 值 4.5 醋酸鈉 25 毫米 (5 CV、滿載 45 毫克的 IgG1 ph 值為 4.5 和 pH 5.0 醋酸鈉 25 毫米

15、用清水洗凈 (2 CV 之前色譜分離。使用源 30 多歲的色譜分色,SP 瓊脂糖凝膠高性能、Capto S 和波羅斯島 50 HS 都在進行線性漸變從 0 到 300 mM 氯化鈉 (10 CV 醋酸鈉25 毫米,在 ph 值 5.0,跟隨由 500 毫米氯化鈉 (3 CV 相同的鈉醋酸緩沖。源 30S 色譜分離在從 0 到 300 mM 氯化鈉的線性漸變進行(10 CV 在 25 毫米無水醋酸鈉 ph 值為 4.5 和 5.0,分別為何;在 ph 值為 6.0 磷酸 12.5 毫米鈉醋酸鈉 12.5 m m。后線性梯度洗脫,列不斷洗脫以 500 毫米氯化鈉(3 CV 與相同 ph 值的緩沖區(qū)

16、中。源 30 年代逐步漸變色譜法在 100 毫米執(zhí)行與氯化鈉 (3 CV,125 毫米 (3 CV, 150 毫米 (3 CV,175 毫米 (3 CV,300 毫米 (2 CV 和 500 毫米(2 CV 在 pH5.0 醋酸鈉 25 毫米。制備型色譜運行精簡蹄筋 A 樹脂被裝在一個 XK26/40 列 (2.6 厘米的身份證× 28 厘米和被平均 20 毫米招聘 ph 7.0 (5 CV。列是加載與 7 L 發(fā)酵上清液,ph 值 7.0,洗后再用以下洗滌議定書規(guī)定: (1 20 毫米招聘 ph 值 7.0,1 M 氯化鈉 (4 CV;(2 20 毫米招聘,pH 7.0 (2 CV

17、;(3 20 毫米招聘 ph 值 7.0,乙二胺四乙酸 10毫米、 10 毫米小伙子們 (6 CV;(4 20 毫米招聘 pH 7.0 (4 CV。列然后被洗脫用線性漸變從 ph 值降低 4.0 到 3.0 的 100 毫米檸檬酸鈉 (3 CV 隨 pH 3.0 (5 CV。流動率是 21 毫升/分鐘。弱酸的分數被調整到與 1 米磷酸鈉,二元,ph 值 8.9 pH 5.0。分數表示 IgG1 高峰被匯集為下一步純化。源 30S 樹脂被裝在一個 XK26/40 列 (2.6 厘米的身份證× 28 厘米和平衡與 ph 值4.5 醋酸鈉 25 毫米 (5 CV。從簡化蹄筋池用水稀釋五倍抗

18、 HER2 人與生物圈(電導率 10 mS/cm、調整到與 1 M 醋酸,pH 4.5 和列上,然后加載。根據上述協議進行了逐步漸變源 30S 色譜法。流率是 10 毫升/分鐘流量快速 SP 瓊脂糖凝膠樹脂被裝在一個 XK16/40 列 (1.6 厘米身份× 35 厘米和平衡與緩沖區(qū) A (5 CV?？?HER2來自源 30 多歲的人與生物圈是用緩沖區(qū) A 稀釋五倍和 SP 瓊脂糖凝膠列上加載。后緩沖區(qū)洗滌 (5 CV,人與生物圈洗脫與 5 列從制訂緩沖區(qū) pH 6.0,150 mM 氯化鈉,0.01%吐 20 組氨酸 10 毫米的簡歷。餾分的高峰期是作為最終產品匯集、通過 0.2聚

19、醚砜膜過濾器過濾和菌存放在 4 。蛋白質濃度抗 HER2 單克隆抗體濃度由測量他在 280 1 厘米石英試管中的吸收毫微米與紫外線分光光度計。使用了 1.42 L g-1 厘米-1 從氨基酸序列計算的理論消光系數。純化的抗 HER2 人與生物圈方案被集中的物理穩(wěn)定性分析和交換制訂緩沖區(qū)中的緩沖區(qū)。調整到 10 毫克/毫升制訂緩沖區(qū)中的抗體并將其存儲在不同溫度下的 4、 25、37 。它分析了每周的大小排除色譜 (SEC 來確定聚合和退化為六個星期。使用Zorbax GF-250 (粒子大小列、 9.4 × 250 毫米 L7420 紫外探測器監(jiān)測 280 的日立 D 7000 高效液

20、相色譜法系統(日立,東京,日本上進行了分析秒毫微米。樣本量是和流動相是 100 毫米磷酸鈉、 ph 值 6.8,150 mM 氯化鈉 0.05%疊氮化鈉在 1.0 ml/min 的流量。SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS 頁和雙向凝膠電泳 SDS 根據具有修改 4 的 Laemmli 方法進行×非減少樣品緩沖 (250 毫米招聘,ph 值 6.8 8 %sds,40 %v / v 甘油,0.4%溴酚藍鈉鹽,100 毫米 N ethylmaleimide 和 4 ×減少樣品緩沖 (250 毫米招聘,ph 值 6.8 8 %sds,40 %v / v 甘油,0.4%溴酚藍鈉鹽2

21、0 %v / vb-巰基乙醇。凝膠是沾滿了 0.025%考馬斯輝煌藍 R 250 在 7 %v / v 醋酸acid/40%v/v 甲醇和 destained 在 10 %v / v 乙酸 60 分鐘。雙向電泳技術是由肯德里克實驗室,Inc.(美國無線麥迪遜 執(zhí)行的標準格式。簡單地說,等電聚焦 (IEF 在進行了用 2 %ph 值 3.5 10 混合的 ampholines 玻璃管 4 L.PH 梯度情節(jié)確定與表面 pH 電極和六個國際盛事基金管凝膠(運行與緩沖區(qū)。原肌球蛋白等電點 pI,5.2列入作為內部的標準樣品。從國際盛事基金管凝膠然后被密封到 10%丙烯酰胺板凝膠運行 SDS 平板凝膠

22、電泳的頂部。丙烯酰胺板凝膠是沾上考馬斯亮藍和之間的玻璃紙床單曬干。蛋白質的 pI 是使用供應商提供的梯度情節(jié)的ph 值確定的。內毒素分析內毒素是使用由查爾斯河 Endosafe (美國馬薩諸塞州威明頓 提供的終點顯色鱟試劑裂解液 (LAL 方法確定的。殘余蛋白分析殘余蛋白 A 確定所述與作了一些修改。96 井過濾塔中捕獲了一種標準和樣品的蛋白涂有反蛋白多克隆抗體。素抗蛋白多克隆抗體被添加到板上形成免疫復合物與捕獲蛋白 A.復雜檢測到與共軛鏈霉親和 AP,其次是基板 4 MUP。該產品由閱讀與 360 進行激發(fā)熒光定量毫微米、排放在 485 nm。通過使用 PicoGreen 試劑根據指令從 I

23、nvitrogen (美國加利福尼亞州卡爾斯巴德確定宿主細胞基因組 DNA 分析宿主細胞基因組 DNA。N-連接糖分析 N-連接糖配置文件確定基質輔助激光解吸/電離 /-飛行時間質譜法測定(解吸電離質譜 使用航海家號德 BioSpectrometry 工作站福斯特市,加利福尼亞州,美國應用生物系統如上文所述具有約束力的測定抗原結合分析法使用 SKBR3 細胞 (美國類型文化收藏 所述稍作修改與執(zhí)行。人與生物圈方案抗原復雜被斑斑 IgG AlexaFluor488 antihuman。番石榴表示加上(番石榴技術、唐熙華,加利福尼亞州,美國檢測到熒光強度 (MFI 的意思是利用勵磁 488 nm

24、和排放在 525 nm。C1q 結合分析法進行細微的修改與所述。人與生物圈-C1q 復雜檢測到與反 C1q 多克隆抗體-AP 共軛,其次是基板 4 MUP。該產品通過閱讀相對熒光單位 (所 與勵磁在 360 量化毫微米、排放在 485 nm。Fc (RI 綁定測定方法進行了如上文所述。結果和討論 A 蛋白親和色譜儀為抗 HER2 單克隆抗體純化蛋白 A 親和層析是單克隆抗 體純化的常用方法。精簡的蹄筋 A 專供抗體純化直接從原油原料的膨脹的床吸附色譜 法。MabSelect 肯定是基因工程蛋白 A 親和樹脂提高了堿穩(wěn)定性為列再生和凈化處理。 MabSelect 確定陳列野生型蛋白 A 樹脂，包

25、括 MabSelect Xtra 和 ProSep vA 超可比綁 定的能力。我們比較 P.酵母發(fā)酵液抗 HER2 單克隆抗體純化的簡化型蹄筋 A 和 MabSelect 確定列綁定能力。這兩個列有類似綁定容量 30 毫克/毫升 (表 1，這是用 純化的人類 IgG 確定其綁定能力相媲美。因此，我們使用兩個列以捕獲從 P.酵母發(fā)酵 液抗 HER2 人與生物圈方案和評價其洗脫條件。 抗體是常規(guī)地洗脫從蛋白 A 親和層析在低 ph 值 (3.0。然而，抗體穩(wěn)定在低 ph 值 (2.5 3.5 并不傾向于聚合。洗脫緩沖液具有更高的 ph 值被用于減少聚合，導致 不完整洗脫抗 HER2 單克隆抗體。精

26、氨酸已被作為一種替代的策略以提升洗脫的 ph 值，防止抗體蛋白 A 親和層析中的聚合。若要優(yōu)化抗 HER2 單克隆抗體洗脫條件，我 們比較蛋白 A 色譜與無洗脫 pH(5.03.0 減少漸變中的精氨酸?？偨Y在表 1 中，在 A280nm 峰值千里馬 pH 出現 pH3.3 流線型蹄筋 A 色譜中，在 pH 3.7 MabSelect 肯定 色譜中時抗 HER2 人與生物圈方案通過從 100 毫米檸檬酸鈉 pH 5.0 到 3.0 的線性漸 變降低洗脫從這兩個列。Ph 值最大值被轉移了 3.7 精簡蹄筋 A 色譜中，當 1 M 精氨 酸被列入。超過 90%的人與生物圈被痊愈的蛋白 A 列中每個這

27、些洗脫條件 (表 1。沒 有人與生物圈方案后洗脫樹脂 （未顯示的數據） 中檢測到。由洗脫用降低 ph 值線性 漸變中存在 1 M 精氨酸防止抗體沉淀?？紤]到其低壓力降在柱層析，我們選擇了在規(guī) 模向上分離純化過程中使用精簡蹄筋 A 并執(zhí)行沒有精氨酸 pH 梯度洗脫洗脫緩沖液中。 陽離子交換色譜法若要移除產品相關雜質 A 中蛋白純化抗 HER2 人與生物圈方案從 P. 酵母中，有一些產品相關的雜質的不同從觀察到在其他表達系統中的雜質。在評估不 同產物包括 CEX、 AEX、 HIC、 信息中心和羥基磷灰石色譜之后, 我們發(fā)現那陽離子 交換色譜法可以執(zhí)行好，除去這些雜質。圖 1A 比較陽離子交換色譜

28、執(zhí)行與 ph 值為 5.0 相同氯化鈉線性梯度洗脫。圖譜的源 30 多歲，波羅斯島 50 HS 和 SP 瓊脂糖凝膠 HP 所有表現良好峰值的決議。然而，峰值決議 Capto S 色譜這可能是由于它的大顆粒 大小，暗示源 30 多歲、 波羅斯島 50 HS 和 SP 瓊脂糖凝膠 HP 能執(zhí)行好，除去雜質 在消失了。 若要確定最佳 ph 值為氯化鈉梯度洗脫，我們比較源 30S 圖譜與氯化鈉線性梯度不同 ph 值為 4.5、 5.0 和 6.0。如圖 1B 所示，ph 值為 4.5 和 5.0，但一些重疊在前兩個 洗脫峰 ph 值為 6.0 有好的決議。要發(fā)展容易放大凈化過程，我們優(yōu)化源 30S

29、色譜與 氯化鈉梯度分離。如圖 1 所示，洗脫峰被好分開在不同濃度 NaCl 在 pH 5.0 醋酸鈉 25 毫米。圖 1 描述了 SDS 分析這些山峰中的樣本。第一次的洗脫峰在 100 mM 氯化鈉所載 misassembled 重傷和抗 HER2 單克隆抗體，其中的輕鏈組成重傷和重鏈， 作為證實由 N-末端氨基酸序列 （數據不會顯示）。第二次的洗脫峰在 125 毫米氯化 鈉載完好無損抗 HER2 人與生物圈與幾個產品相關的雜質。小洗脫峰或以上 150 mM 氯化鈉被 misassembled 單克隆抗體，其中的重鏈、 劈重鏈和輕鏈的混合物組成。這 些結果表明在蛋白質純化的抗 HER2 人與生

30、物圈方案從 glycoengineered P.酵母中，產 品相關的雜質來自 misassembling 劈重鏈、 重鏈和輕鏈。陽離子交換色譜法在最優(yōu)氯 化鈉梯度 ph 值為 4.5-6.0，可以有效去除這些雜質。 規(guī)模向上凈化過程基于上述優(yōu)化小柱純化的條件，我們開發(fā)了強大且可擴展的純化工 藝生產的高品質抗 HER2 人與生物圈方案從 10 到 40 L P.酵母發(fā)酵的克。后經過發(fā)酵 上清液通過簡化蹄筋 A 列，非特定綁定雜質被從列通過洗滌，和抗體以降低 ph 值 4.0 到 3.0 從梯度洗脫?？贵w池從靶點色譜法是以五折的量減少到 10 mS/cm 電導率用水 稀釋，直接應用到源 30 列若

31、要移除產品相關的雜質。抗體被洗脫 ph 值為 5.0 使用逐 步氯化鈉漸變。最后，從源 30 列抗體是應用于 SP 瓊脂糖凝膠快速流動的列和洗脫與 制訂緩沖區(qū)作為最終產品。此分離純化過程消除了耗費時間緩沖區(qū)交換過程之間每個 色譜法步驟，可能會引入蛋白質降解和聚合。圖 2A 顯示 SDS 分析的每一步純 化過程中的抗 HER2 單克隆抗體產品和其商業(yè)對應產品，曲妥珠單抗在 CHO 細胞生產。 數據表明我們兩步純化過程可以產生抗 HER2 人與生物圈方案從 P.酵母發(fā)酵和實現曲 妥珠單抗作為同一純度。此分離純化過程一般被用來凈化其他 IgG1、 IgG2 和 IgG4 的單克隆抗體，針對不同的抗原

32、。圖 2B 是其他三個代表性 mAbs 從 glycoengineered P.酵母中的 SDS 分析和演示產品的高效去除相關雜質，達到純度高。 表 2 概述了抗 HER2 單克隆抗體純化過程的結果。所含的蛋白 A 純化的抗 HER2 產品 約 20%的產品相關雜質，完全被從完好的抗體產品源 30S 色譜法。分離純化過程表明 生產最后抗 HER2 單克隆抗體產品的純度為 99%，實現 60%的總體恢復從捕獲的蛋 白 A 蛋白質?？?HER2 蛋白的單克隆抗體親和層析所載 290 ppm 的殘余蛋白 A，共同 洗脫抗體從列。源 30S 和 SP 瓊脂糖凝膠色譜法后, 殘余蛋白 A 500-fol

33、d 幾乎減少了 到 0.6 ppm (表 2，最終產品中。蛋白 A 純化抗 HER2 單克隆抗體了低水平的宿主細 胞 DNA （< 7 ppm 和內毒素 (0.6 歐盟毫克。在最終產品中，宿主 DNA 進一步減少 了超過 20 倍到 < 0.3 ppm 和內毒素 2 折減至 0.3 歐盟/毫克 (表 2。宿主細胞蛋白雜 質，最終產品中的幾乎沒有檢測到使用多克隆抗體內部免疫印跡法檢測。多克隆抗體 在兔用畢宿主細胞蛋白作為抗原 （數據不會顯示） 提出。 通過使用秒來檢測聚合或降解表征抗 HER2 單克隆抗體單克隆抗體抗 HER2 從 glycoengineered P.酵母中的物理穩(wěn)定性進行了評估?？?HER2 人與生物圈方案制訂緩 沖區(qū)中的被存儲時 4、 25、 37 ，為期六個星期，沒有大量的聚合或降解檢測到由 SEC 分析。后在 37 為 6 周 （圖