嚙齒類小鼠γ-干擾素原核表達(dá)純化及功能鑒定-2019年文檔

1、嚙齒類小鼠Y -干擾素原核表達(dá)、純化及功能鑒定Prokaryotic expression and purification of murine interferon-gammaLIU Xiao-hui, CHEN Zhuo-jia, DU Jun(Department of Microbiology and Biopharmaceutics inSchool of Pharmaceutical Sciences,Sun Yat-sen University ， Guangzhou510080，China) Objective:To clone murine interferon-gamma

2、gene, do effective prokaryotic expression and purify recombinant murine IFN- 丫 for further study.Methods:To amplifymIFN-丫 cDNA from ConA-activated murine splenocytes by RT-PCR and clone into pET30a(+) vector Then the target protein His6-mlFN- 丫 was induced by IPTG and purified with Ni2+-NTA agarose.

3、 The biologic activity was identified by western blotting.Results:The prokaryotic expression system of mIFN- 丫 was constructed . And the fusionproteinmIFN-丫 was dissoluble and bioactive.Conclusion:The tech no logy of mIFN- 丫 producti on is successfully optimized. It lays a foundation of further rese

4、arch of IFN-丫 s IFN- 丫； Prokaryotic expression； Purification英國國立醫(yī)學(xué)研究所的 Isancs 和 Lindenman 在研究病毒的 干擾現(xiàn)象時(shí)發(fā)現(xiàn)了一種可溶性物質(zhì)， 進(jìn)一步研究表明這一物質(zhì)能 夠抑制多種病毒在細(xì)胞內(nèi)的繁殖，于是將其命名為干擾素 (interferons ，IFN) 1 。干擾素是一類由低分子可溶性蛋白 組成的重要細(xì)胞因子， 自 1957年 Isancs 首次發(fā)現(xiàn)雞干擾素以來， 先后已有人、鼠、犬以及豬等動(dòng)物的干擾素基因被成功克隆。 IFN- 丫具有很強(qiáng)的抗病毒活性、免疫調(diào)節(jié)活性和抗腫瘤活性。 IFN- 丫可通過多種途

5、徑來發(fā)揮抗腫瘤作用，既通過延長(zhǎng)細(xì)胞周 期以延緩腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖； 又可通過抑制癌基因的表達(dá)來 阻止或減慢腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程； 還可誘導(dǎo)腫瘤壞死因子 (tumor necrosis factor- a, TNF-a )上調(diào)癌細(xì)胞對(duì) TNF 受體、MH(E 類 抗原等的表達(dá)，使其易被殺傷性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic Tlymphocyte, CTL) 識(shí)別而被殺傷 2 。當(dāng)病原體侵入機(jī)體組織后， 淋巴細(xì)胞在感染部位聚集并釋放 干擾素等細(xì)胞因子。IFN- 丫主要通過JAK-STAT途徑來發(fā)揮作用 的。IFN- 丫與幾乎分布于所有正常細(xì)胞表面的高親合力的受體 IFN- 丫 R(IFNGR結(jié)合并

6、使受體發(fā)生二聚化后，受體的胞內(nèi)近膜 區(qū)可與胞漿內(nèi)非受體TPK-JAK激酶(janus kinase)結(jié)合并發(fā)生磷 酸化，進(jìn)而與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子 1(signal transducers and activators of transcription, STAT-1)相結(jié)合。在 JAK催化下， STAT-1 結(jié)合成活化的 STAT-1 二聚體轉(zhuǎn)移入核，他們通過與 IFN- 丫 活化位點(diǎn)(gamma-interferonactivationsites , GAS)結(jié)合而誘導(dǎo)免疫活性蛋白表達(dá)，如CD54吲哚胺2, 3 一加氧酶3 (idoleamine 2,3-dioxygenase, IDO

7、)等。據(jù)資料顯示，我國在嚙齒類 丫 -干擾素的克隆、制作方面還 趕不上其他國家。盡管國外已經(jīng)制備有基因重組嚙齒類Y-干擾素，但是由于其開發(fā)成本高、前期投入大，用于腫瘤藥物的基礎(chǔ) 研究，價(jià)格相當(dāng)昂貴， 這也嚴(yán)重地限制了我國相關(guān)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研 究。因此本研究進(jìn)行嚙齒類丫-干擾素的制備對(duì)腫瘤藥物的相關(guān)研究將具有重要的實(shí)際意義 4 。1 材料與方法1.1 材料5周C57BL/6雄鼠，由中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。pET30a(+),購自Novagen公司。大腸桿菌JM109和BL21由本實(shí) 驗(yàn)室保存。限制性核酸內(nèi)切酶 BamHI和Hi nd山、Taq DNA聚 合酶、T4 DNA連接酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶均購

8、自 TaKaRa公司；IPTG 購自華美生物工程公司； 凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒購自 Omega Bio-tek 公司；鎳離子螯合層析柱購自 Pharmacia 公司。 一抗兔抗IDO來自本實(shí)驗(yàn)室保存5 ; B -actin多克隆抗體購自 杰特偉公司；羊抗兔 HRP購自博士德生物XX公司；蛋白定量試 劑為 Bio-Rad 公司的 Bio-Rad Protein Assay 試劑盒； RPMI 1640、DMEI培養(yǎng)基粉末購自 Gibco公司；新生牛血清(NPS購 自PPA公司；小鼠mIFN- 丫標(biāo)準(zhǔn)品購自晶美生物工程 XX公司； 其余試劑為國產(chǎn)分析純。1.2 方法1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合

9、成根據(jù) NCBI Gene Bank 發(fā)表的序列設(shè) 計(jì)引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù) XX公司合成。其序列為， 上游引物：5' -CAGAGCTTTCAGCAGCAGCTCCTTT(C-BamHI 位點(diǎn))；下游引物：5 ' -TCGGATCCCACGGCACAGTCATT3AAA含- Hind山位點(diǎn))。1.2.2目的基因的獲取健康 6周齡的雄性C57BL/6小鼠，無 菌條件下取脾，放入盛有 5 ml不含血清RPMI1640的培養(yǎng)皿中， 不銹鋼網(wǎng)( 200目)磨碎過濾，使之成為單細(xì)胞懸液。離心，棄 上清，加入含有10 %新生牛血清RPMI164Q調(diào)整濃度為5X 106 個(gè)/ml

10、 , ConA(8 卩 g/ml)誘導(dǎo) 24 h(37 C, 5% CO2。用 Trizol 二步法進(jìn)行RT-PCFT增。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4C預(yù)變性5 min;94 C變性30 s , 52C退火30 s , 72C延伸1 min，循環(huán)擴(kuò) 增30次，最后72C延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2 %瓊脂糖凝膠 電泳鑒定。1.2.3 pET30a(+)/mlFN- 丫 原核表達(dá)載體 的構(gòu)建與鑒定PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，BamHI和 Hind山雙酶切，凝膠回收試劑盒純化回收。質(zhì)粒小提試劑盒小 提質(zhì)粒pET30a(+);質(zhì)粒pET30a(+)經(jīng)Bam HI和口 Hi nd山雙酶切，

11、 凝膠回收試劑盒純化回收。T4 DNA連接酶連接純化的PCR產(chǎn)物和pET30a(+)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌JM109,卡那霉素抗性篩選，PCR及酶切鑒定陽性重組質(zhì)粒pET30a（+）/mlFN- 丫。將 pET30（+）/mlFN- 丫 轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿 菌BL21，從轉(zhuǎn)化平板上隨機(jī)挑取單菌落，在 3 ml LB中37C震 蕩培養(yǎng)1216 h，菌液-80C凍存。1.2.4 His6-mlFN- 丫蛋白的融合表達(dá)取凍存菌接種于45ml的LB （卡那霉素50 ng/ml ） , 37C培養(yǎng)過夜，按 1 : 50轉(zhuǎn)接 于LB （含卡那霉素50 ng/ml ）中，37C培養(yǎng)至0D值為0.6

12、0.8 , 加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG 37C震蕩培養(yǎng)3 h，并設(shè)IPTG 未誘導(dǎo)對(duì)照組。離心收集1.5 ml菌液，進(jìn)行SDS-PAG表達(dá)分析。1.2.5 工程菌裂解后融合蛋白的可溶性鑒定取蛋白表達(dá)陽性的凍存菌種于 45 ml的LB （卡那霉素50 ng/ml ） , 37C培 養(yǎng)過夜，按1 : 50轉(zhuǎn)接于LB （含卡那霉素50 ng/ml ）中，37C 培養(yǎng)至 OD值為0.60.8，加入終濃度為 0.5 mmol/L的IPTG 25C 震蕩培養(yǎng)7 h，離心收集1.5 ml菌液，冰上適量溶菌酶裂解緩 沖液裂解菌體，超聲裂菌（輸出頻率為25 Hz, 4C, 30 s X 10）。

13、 4C ,15 000 r/min離心15 min，分別取適量上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAG電泳，分析目的蛋白的分布，其余凍存于-80C冰箱。1.2.6融合蛋白His6-mIFN- 丫的純化架好鎳離子親和層析 柱，先以 Washing buffer 流洗（流速為 2 ml/min） 達(dá)平衡后，換 成 Native Binding buffer 使其管柱結(jié)合上新的鎳離子。再以 Washing buffer 流洗達(dá)平衡后，注入保存的蛋白上清液，以 Binding buffer 流洗（流速為 1 ml/min ）約 250 ml。再以 Washing buffer 流洗（流速為 2 ml/min）約

14、300 ml。最后以 Elution buffer 洗脫，連續(xù)收集洗脫液，每次收集 14 ml 。分別取少量 Binding buffer 洗脫液，末次 Washing buffer 洗脫液及 Elution buffer 洗脫液進(jìn)行SDS-PAG分析。1.2.7 純化蛋白的超濾將收集到的 Elution buffer 洗脫液 放入截流孔徑5 KD的超濾管中，超濾20 min , 2 800 g/min , 4C。 用PBS和 5%的甘油清洗，繼續(xù)超濾 20 min , 2 800 g/min。收 集超濾后的蛋白，分裝于 1.5 mlEP管中，凍存于-80C冰箱中。1.2.8 Western

15、Blotting鑒定融合蛋白 His6-mlFN- 丫 的生物學(xué)活性以小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7作為待測(cè)樣本，檢測(cè)IFN- 丫 誘導(dǎo)前后細(xì)胞內(nèi)IDO表達(dá)的情況。取標(biāo)準(zhǔn)小鼠IFN- 丫作為陽性 對(duì)照，均誘導(dǎo) 24 h 。光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化。 Western Blotting 參照分子克隆方法進(jìn)行。電壓 80100 V 進(jìn)行 10%SDS-PAG電泳，電轉(zhuǎn) 100 V , 70 min。2 結(jié)果2.1 目的基因的獲取應(yīng)用設(shè)計(jì)的特異性引物，采用 RT-PCRT增mIFN- y , 1.2 % 瓊脂糖凝膠電泳分析，可見 426 bp 左右有一條特異條帶，與預(yù) 期片段大小相符；見圖 1。2

16、.2 pET30a(+) /mIFN- y 原核表達(dá)載體的鑒定克隆至pET30a(+)載體的重組質(zhì)粒以 BamHI和Hi nd山雙 酶切后，分別切出 426 bp 和 5 422 bp 左右 2 個(gè)片段，見圖 2。 與預(yù)想結(jié)果一致，證明構(gòu)建重組質(zhì)粒成功。His6-mIFN- 丫的表達(dá)和純化 pET30a(+)/mlFN- 丫轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21，隨機(jī)挑選單克隆菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)經(jīng) IPTG誘 導(dǎo)后，SDS-PAG分析，可看到目的蛋白在 2、5和6號(hào)菌落中得 到融合表達(dá)。經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白的 Mr約18 kDa，與其理論 值基本接近，表明 pET30a(+)/mIFN- 丫可以在大腸桿菌中

17、 BL21 融合表達(dá)，見圖 3。超聲裂解菌后分別取適量上清和沉淀做SDS-PAG，E 發(fā)現(xiàn)目的蛋白多集中在上清液，大部分是以可溶形式表達(dá)，見圖4。陽性菌株經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)及IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，用鎳離子親和層析柱純化收集到的可溶性蛋白， SDS-PAG分析，可看到29號(hào)收 集液在 18 kDa 左右均有一條清晰的條帶，并且 59號(hào)收集液中 幾乎沒有雜帶?？梢娎面囯x子親和層析柱對(duì) His6-mIFN- 丫蛋 白液的純化效果極好，見圖 5。2.3 His6-mIFN- 丫生物活性鑒定分別將純化的重組蛋白 His6-mlFN- 丫和標(biāo)準(zhǔn)品mIFN-丫刺激小鼠巨噬細(xì)胞系 RAW264.7， 24 h 后可見受

18、刺激的細(xì)胞發(fā)生明 顯的形態(tài)學(xué)變化，見圖 6。 Western Blotting 分析可見經(jīng)His6-mIFN- 丫和標(biāo)準(zhǔn)品 mIFN-丫誘導(dǎo)后，RAW264.7表達(dá)IDO的 活性明顯升高，見圖 7。圖1PCR產(chǎn)物電泳圖M: DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2000;1 : PCR產(chǎn)物Fig.1 Electrophoresis map for PCR productsM：DNA Marker DL 2000;1 ：PCR amplification圖 2重組質(zhì)粒的酶切電泳圖1: PCR擴(kuò)增產(chǎn)物mIFN- 丫片段；2 :經(jīng)雙酶切的重組質(zhì)粒;3:未經(jīng)處理的重組質(zhì)粒；M: DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2000Fig.2 Res

19、triction enzyme digestion analysis of the recombinant plasmid1: PCR amplification mIFN-丫 ；2 : BamHI + Hind 山pET30/mlFN- 丫 ；3: pET30/mIFN- 丫 ；M, DNA Marker DL 2000圖3IPTG誘導(dǎo)蛋白的 SDS-PAGEM中分子量蛋白marker ； 1 :未加IPTG誘導(dǎo)菌液總蛋白； 26: IPTG誘導(dǎo)菌液總蛋白Fig.3SDS-PAGE of induced products with IPTGM:protein molecular weight

20、 marker; 1:UninducedpET30a(+)/mlFN- 丫 ；26: induced pET30a(+)/mIFN- 丫圖4超聲裂解菌SDS-PAG電泳M中分子量蛋白marker； 1:裂解菌后的上清液；2：裂解 菌后的沉淀物Fig.4 SDS-PAGE of split productsM：Protein molecular weight marker； 1：Superior liquid of split products；2： Deposit of split products圖5純化嚙齒類Y -干擾素的SDS-PAGESM 中分子量蛋白 marker ； 1: Bind

21、ing buffer 洗脫液；2： 末次 Washing buffer 洗脫液， 39： Elution buffer 洗脫液Fig.5 SDS-PAGE analysis of the purification ofrecomb inant muri ne IFN-丫 (m IFN- 丫 )M： moderate protein molecular weight markers ； 1 ： Binding buffer eluent ；2： ultimate Washing buffer eluent 3-9 ，Elution buffer eluent圖6mIFN-丫刺激RAW264.7后

22、的形態(tài)學(xué)變化1:未加mIFN- 丫刺激的RAW264.7細(xì)胞形態(tài)；2:標(biāo)準(zhǔn)品 mIFN-丫刺激后的RAW264.7細(xì)胞形態(tài)；3: His6-mIFN- 丫刺激后 的RAW264.7細(xì)胞形態(tài)Fig.6 microscope observation of RAW264.7 induced bymIFN- 丫1: morphology of RAW264.7without IFN- 丫 ； 2: morphology of RAW264.7induced by mIFN-丫 standard ； 3: morphology of RAW264.7 with His6-mIFN - 丫圖7IDO在RAW264.7細(xì)胞中的表達(dá)情況1: His6 -mIFN- 丫刺激后RAW264.7細(xì)胞溶胞產(chǎn)物；2:標(biāo) 準(zhǔn)品mIFN-丫刺激后RAW264.7細(xì)胞溶胞產(chǎn)物；3:未加工mlFN-丫 刺激的R