采取改良SDS法對(duì)天麻花葶DNA提取研究

1、采取改良SDS法對(duì)天麻花葶DNA提取研究關(guān)鍵詞： 天麻；基因組DNA；DNA提取采取改良SDS法對(duì)天麻花葶DNA提取 研究 *【摘要】 以天麻花葶為材料，采用改良SDS法對(duì)天麻DNA提取進(jìn)行了研究，經(jīng)紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，能得到高純度的DNA，OD260/OD280在1.751.9之間，蛋白質(zhì)、多糖、RNA等去除較徹底，適于進(jìn)一步 分析 。【關(guān)鍵詞】 天麻；基因組DNA；DNA提取Study on extraction of DNA of Gastrodia elata.scape in an improved SDS method【Abstract】TheDNA of Gast

2、rodia elata.scape were extracted with an improved SDS method.The extracted DNA was examined by ultraviolet absorption test and agarose gelelectrophoresis.The results showed that the improved SDS method was suitable for DNA extraction in Gastrodia elata.The purity of the extracted DNA was very high w

3、ith OD260/OD280 value of 1.751.9.The protein，polyhexose and RNA were eliminated completely.It could be used for analysis.【Key words】 gastrodia elata；genome DNA；DNA extracting從藥材天麻花葶中提取到高質(zhì)量的DNA，是成功構(gòu)建DNA指紋圖譜的前提。有效去除DNA所含的雜質(zhì)(糖類、酚類等)，避免多糖、多酚、色素等 影響 DNA聚合酶的活性是獲取高質(zhì)量DNA的關(guān)鍵。近來(lái)植物總DNA提取的 方法 主要有兩種：CTAB法和SDS法。由

4、于本實(shí)驗(yàn)所選材料為新鮮天麻幼嫩的花葶，一是避免DNA分子發(fā)生降解，二是天麻花葶為新鮮幼嫩部分，為其生長(zhǎng)點(diǎn)DNA含量高且次生代謝產(chǎn)物少，避免多糖及酚類雜質(zhì)影響DNA的純度和產(chǎn)率。故選用了操作簡(jiǎn)單、性質(zhì)溫和的改良的SDS法提取天麻基因組DNA。1 材料與方法1.1 儀器材料 DYY-8B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京市六一儀器廠)、JUNYI電泳儀(北京市六一儀器廠)、凝膠成像儀(Biorad公司)、Smartspec TM3000DNA濃度的測(cè)定儀(Biorad公司)?！癝”提取液、TE緩沖液、苯酚：氯仿(11)、氯仿異戊醇(241)、氯仿、異丙醇、3mmol/L NaAc 10mg/ml RNase

5、A。植物材料為蘭科天麻(Gastrodia elata Blume.)新鮮花葶。以野生型天麻和種植型天麻為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，編號(hào)分別為1、2、3、4、5(其中1、2為大方GAP栽培品烏天麻，3、4、5為野生品烏天麻)，由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院王曉麗教授鑒定、提供。1.2 方法1.2.1 天麻基因組DNA提取 本研究在Edwards等(1991)2，3提取DNA方法的基礎(chǔ)上，做了以下改進(jìn)，具體操作步驟如下：(1)取新鮮和幼嫩的天麻花葶用70%的乙醇清洗表面，用滅菌去離子水沖洗干凈；(2)放入預(yù)冷的研缽與液氮共研成細(xì)粉，取少許粉末加入1.5ml Eppendorf管中，迅速加入預(yù)熱至65的“S”提取液750l，經(jīng)搖充

6、分混勻，在65水浴中保溫12h，其間顛倒混勻數(shù)次，取出，10000r/min離心10min；(3)加等體積的苯酚：氯仿(11)，輕輕搖勻，10000r/min離心10min，轉(zhuǎn)移上清液；(4)加等體積的氯仿溶液，混勻后，10000r/min離心10min，轉(zhuǎn)移上清液；(5)加0.6倍體積預(yù)冷的異丙醇，輕輕混勻，于-20靜置30min；(6)用槍頭小心挑出絮狀DNA，加150l的70%乙醇沖洗2次；勾出的DNA，在通風(fēng)櫥中風(fēng)干，加100150l 1TE，溶解；(7)加34l RNase A，37放置12h，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的去除情況，再加500l1TE緩沖液；重復(fù)(3)(4)過(guò)程，將(

7、3)中的苯酚：氯仿(11)用氯仿：異戊醇(241)取代：取上清液加入1/10體積3M NaAc，混勻后，加入2倍體積的冰凍乙醇，于-20靜置20min，沉淀DNA；加150l 70%乙醇洗脫2次，勾出的DNA，室溫風(fēng)干；加50300l 1TE溶液溶解DNA，4下保存。1.2.2 DNA的質(zhì)量檢測(cè) 用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，EB(溴化乙啶)染色，進(jìn)行DNA質(zhì)量檢測(cè)，電泳緩解液為1TAE，電壓為80V，電泳12h，然后在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察攝像。1.2.3 DNA的濃度檢測(cè) 取2l DNA溶液用1TE稀釋100倍，在核酸分析儀上，測(cè)定在260nm/280nm波長(zhǎng)下的吸收值，根據(jù)A260/A280

8、判斷DNA純度，A280值 計(jì)算 DNA產(chǎn)率。并計(jì)算OD值(A260/A280)，調(diào)整所有DNA的量至200500ng/l左右。2 結(jié)果與分析本試驗(yàn)采用SDS法提取天麻基因組DNA，SDS法操作簡(jiǎn)單，溫和，可提取到較高分子量DNA，經(jīng)DNA的質(zhì)量檢測(cè)顯示，其分子量太小約23.2kb，點(diǎn)樣孔不發(fā)亮，DNA主帶清晰，無(wú)彌散帶，無(wú)明顯的RNA帶，說(shuō)明天麻的RNA、蛋白質(zhì)、多糖以及其他次生代謝物質(zhì)去除的比較干凈，純度較高(見(jiàn)圖1)。經(jīng)DNA的濃度測(cè)定顯示DNA濃度在3.0mg/g以上，A260/A280值均在1.75以上(見(jiàn)表1)，說(shuō)明質(zhì)量較高。圖1 天麻DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表1 DNA樣品的濃度

9、測(cè)定結(jié)果3 討論3.1 天麻塊莖含有大量的糖類、酚類以及蛋白質(zhì)等物質(zhì)，如果選用干品藥材，由于老化和貯存時(shí)間較長(zhǎng)，植物材料中多糖和酚類含量較高，從中提取得到的DNA，常會(huì)和多糖、酚類形成共沉淀而成膠凍狀或黃褐色，嚴(yán)重 影響 了DNA的得率和質(zhì)量。在天麻生活史中，大部分階段都與蜜環(huán)菌共生，因此選擇適當(dāng)?shù)碾A段和部位對(duì)DNA的提取也很重要。由于初生塊莖的皮層細(xì)胞內(nèi)有蜜環(huán)菌，故用初生塊莖提取DNA時(shí)，要去除蜜環(huán)菌，最好取生長(zhǎng)點(diǎn)部位的組織，這樣既可避免蜜環(huán)菌DNA污染，又可得到產(chǎn)量較高的DNA。新鮮和幼嫩的植物材料因其含有較完整的DNA，從天麻花葶的幼嫩部分提取DNA是最理想的部位。一方面花葶沒(méi)有蜜環(huán)菌侵

10、染，同時(shí)花葶又是形成花和花序的生長(zhǎng)點(diǎn)部分，細(xì)胞中含有豐富的DNA。從該部分提取DNA，通常能獲得產(chǎn)量高、質(zhì)量好的DNA。但從花葶提取DNA，因受天麻生長(zhǎng)季節(jié)的限制，通常只有當(dāng)天麻開花時(shí)才能取材。3.2 從不同的植物材料中獲得基因組DNA只是在得率和純度以及對(duì)后續(xù)反應(yīng)的影響等方面有所差異，但因各 方法 本身具有不同的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，故針對(duì)不同的植物材料或同一樣本的不同部位，應(yīng)選擇最適合的方法來(lái) 應(yīng)用 46。本實(shí)驗(yàn)采用改良的SDS法提取天麻基因組總DNA。應(yīng)用此方法并通過(guò)采用較大離心力和較長(zhǎng)離心時(shí)間以及以異丙醇反復(fù)沉淀等步驟提取了片段較完整的基因組。3.3 用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，EB(溴化乙錠)染

11、色，進(jìn)行DNA質(zhì)量檢測(cè)，所得的DNA主帶清晰明亮，無(wú)彌散帶，無(wú)明顯的RAN帶，說(shuō)明RNA、蛋白質(zhì)以及其他次生代謝物質(zhì)去除的比較干凈，DNA含量高，純度較高，可用于進(jìn)一步 分析 ?！?參考文獻(xiàn) 】1 Vos P.AFLP:a new technique for DNA fingerprinting.Nucleic Acid Res，1995，23:4407.2 Edwards K，Johnstone C，Thompson C.A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis.Nucleic Acids Research，1991，19:1349.3 Mc Donald MB，LJ，Elliot PM，Sweeney.DNA extraction from dry seeds for RAPD analyses in varietal identification studies.Seed Sci& Techol，1995，22:171-176.4 李曉波，馮波，張朝暉，等.植物藥材總DNA提取.中草藥，2002，33(7)：652-654.5 王景雪，孫毅，高武軍