電泳純度(非還原型SDS-PAGE)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、細(xì)胞因子電泳純度(非還原型 SDS-PAGE 測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程 依據(jù):中華人民共和國(guó)藥典 2005年版第三部。范圍 :適用于細(xì)胞因子純度的檢測(cè)。目的 :檢測(cè)細(xì)胞因子蛋白質(zhì)純度。原理 :蛋白質(zhì)具有不同的電荷和分子量,在經(jīng)過(guò)陰離子去污劑 SDS 處理后,蛋 白質(zhì)分子上的電荷被中和,在聚丙稀酰胺凝膠電泳時(shí),不同的蛋白質(zhì)按照其分子量 大小進(jìn)行分布,電泳遷移率僅取決于蛋白質(zhì)的分子量。由于不連續(xù)的 PH 梯度作用, 樣品被壓縮成一條狹窄區(qū)帶, 采用染色液染色, 經(jīng)掃描儀掃描膠片可及時(shí)觀察結(jié)果。 內(nèi)容:1 材料1. 1樣品:經(jīng)二人復(fù)核批號(hào)無(wú)誤后檢測(cè)1. 2試劑甲醇 CH3OH 分析純無(wú)水乙醇 CH 3 CH

2、2OH 分析純濃鹽酸 HCl 分析純甘油 C 3 H8O3分析純硝酸銀 AgNO3分析純重鉻酸鉀 K 2 Cr2O7分析純正丁醇 C 4 H9OH 分析純甲醛 HCHO 分析純丙烯酰胺 CH 2 CHCONH2分析純甲叉雙丙烯酰胺(CH 2 CHCONH22CH2分析純過(guò)硫酸銨 (NH 4 2S2O8分析純TEMED (四甲基乙二胺 (CH 3 2N(CH22N(CH32分析純甘氨酸 C 2 H5NO2分析純SDS (十二烷基硫酸鈉 C 12 H25O4SNa 分析純乙酸 CH3COOH 分析純碳酸鈉 Na 2 CO3分析純溴酚藍(lán) C 19 H10Br4O5S 分析純1. 3注射用水:符合中華

3、人民共和國(guó)藥典 2005年版要求。1. 4設(shè)備1. 4. 1扭力天平 上海第二天平儀器廠1. 4. 2垂直板狀電泳槽 北京東方儀器廠1. 4. 3恒溫恒流電泳儀 法瑪西亞公司1. 4. 4快速電泳槽 BIORAD USA1. 4. 5全自動(dòng)掃描儀 CS-930 日本島津1. 4. 6TS-1型搖床1. 5器皿:500ml 瓶、 100ul 移液器、 1ml 吸管、 10ml 吸管 3000ml 三角瓶、平 皿、 1000ml 燒杯、 80ml 燒杯,以上器皿經(jīng)本室洗刷組處理。2 方法2. 1準(zhǔn)備工作2. 1. 1工作環(huán)境:控制區(qū),確認(rèn)場(chǎng)地清場(chǎng)合格,摘下“清場(chǎng)合格”標(biāo)志牌, 掛上“使用中”標(biāo)志牌

4、。2. 1. 2調(diào)試儀器設(shè)備2. 1. 2. 1恒溫恒流電泳儀工作狀態(tài)良好,已經(jīng)掛“備用”標(biāo)志牌。2. 1. 2. 2全自動(dòng)掃描儀工作狀態(tài)良好,已掛“備用” 標(biāo)志牌。2. 1. 2. 3扭力天平工作狀態(tài)良好,已掛“備用” 標(biāo)志牌。2. 1. 3摘下扭力天平“備用” 標(biāo)志牌,掛“運(yùn)行中” 標(biāo)志牌。2. 1. 4配液:以下溶液的配制完成后,均需經(jīng)二人復(fù)核無(wú)誤后,在瓶外貼標(biāo) 簽,注明溶液的名稱、濃度、體積、批號(hào)及配制日期。2. 1. 4. 1聚丙烯酰胺凝膠母液 100ml用扭力天平準(zhǔn)確稱取丙烯酰胺 30g, 甲叉雙丙烯酰胺 0.8g ,加 50ml 注射用水溶 解后定容至 100ml ,過(guò)濾,置于棕

5、色瓶中,二人復(fù)核,貼簽,標(biāo)明溶液的名稱、濃 度、體積、批號(hào)、配制日期, 4冰箱放置。一般不超過(guò) 12個(gè)月。2. 1. 4. 2分離膠緩沖液 100ml用扭力天平準(zhǔn)確稱取 Tris18.15g ,溶于 80ml 注射用水中,溶解后,加濃鹽酸 調(diào)節(jié) pH8.8,補(bǔ)加注射用水至 100ml ,置于 250ml 瓶中,二人復(fù)核,貼簽,標(biāo)明溶液的名稱、濃度、體積、批號(hào)、配制日期, 4冰箱放置。2. 1. 4. 3濃縮膠緩沖液 100ml用扭力天平準(zhǔn)確稱取 Tris6.05g ,溶于 80ml 注射用水中,溶解后,加濃鹽酸調(diào) pH6.8,補(bǔ)加注射用水至 100ml ,置于 250ml 瓶中,二人復(fù)核,貼簽

6、,標(biāo)明溶液的名 稱、濃度、體積、批號(hào)、配制日期, 4冰箱放置。2. 1. 4. 4 1%SDS 50ml用扭力天平準(zhǔn)確稱取 SDS 0.5g,溶于 50ml 注射用水中,溶解后,置于棕色瓶 中,二人復(fù)核,貼簽,標(biāo)明溶液的名稱、濃度、體積、批號(hào)、配制日期,常溫保存。 2. 1. 4. 5 1% TEMED 50ml用吸管準(zhǔn)確吸取 TEMED0.5ml ,溶于 50ml 注射用水中,二人復(fù)核,貼簽,標(biāo)明 溶液的名稱、濃度、體積、批號(hào)、配制日期, 4冰箱放置。2. 1. 4. 6 1% 過(guò)硫酸銨 50ml用扭力天平準(zhǔn)確稱取過(guò)硫酸銨 0.5g ,溶于 50ml 注射用水中,二人復(fù)核,貼簽, 標(biāo)明溶液的

7、名稱、濃度、體積、批號(hào)、配制日期, 4冰箱放置。2. 1. 4. 7電極緩沖液 3000ml用扭力天平準(zhǔn)確稱取 Tris9g 、 甘氨酸 43.2g 、 SDS3g , 溶于 2000ml 注射用水中, 補(bǔ)加注射用水至 3000ml ,置于 3000ml 三角瓶中,二人復(fù)核,貼簽,標(biāo)明溶液的名 稱、濃度、體積、批號(hào)、配制日期,常溫貯存。2. 1. 4. 8固定液 500ml用量筒準(zhǔn)確量取甲醇 250ml ,乙酸 50ml ,補(bǔ)加注射用水至 500ml ,置于 500ml 瓶中,二人復(fù)核,貼簽,標(biāo)明溶液的名稱、濃度、體積、批號(hào)、配制日期,常溫貯 存。2. 1. 4. 9洗液 3000ml用量筒準(zhǔn)

8、確量取無(wú)水乙醇 300ml ,乙酸 150ml ,補(bǔ)加注射用水至 3000ml ,置于 3000ml 三角瓶中,二人復(fù)核,貼簽,標(biāo)明溶液的名稱、濃度、體積、批號(hào)、配制日 期,常溫貯存。2. 1. 4. 10重鉻酸鉀溶液 200ml用扭力天平準(zhǔn)確稱取重鉻酸鉀 10g ,加注射用水至 200ml ;加濃 HNO32ml 搖勻溶 解,置于棕色瓶中,二人復(fù)核,貼簽,標(biāo)明溶液的名稱、濃度、體積、批號(hào)、配制日期,常溫保存。2. 1. 4. 11硝酸銀溶液 200ml用扭力天平準(zhǔn)確稱取硝酸銀 0.4g ,加注射用水至 200ml ,置于棕色瓶中,避光 保存,二人復(fù)核,貼簽,標(biāo)明溶液的名稱、濃度、體積、批號(hào)、

9、配制日期,限當(dāng)次 試驗(yàn)使用。2. 1. 4. 12顯色液 3000ml用扭力天平準(zhǔn)確稱取 Na 2 CO318g , 加注射用水至 3000ml , 溶解后, 加 0.6ml 甲醛,置于 3000ml 三角瓶中,二人復(fù)核,貼簽,標(biāo)明溶液的名稱、濃度、體積、批號(hào)、配 制日期,常溫貯存。2. 1. 4. 13終止液 500ml用吸管準(zhǔn)確吸取乙酸 5ml ,溶于 500ml 注射用水中,置于 500ml 瓶中,二人復(fù) 核,貼簽,標(biāo)明溶液的名稱、濃度、體積、批號(hào)、配制日期,常溫貯存。2. 1. 4. 14樣品處理液(非還原型 10ml用扭力天平準(zhǔn)確稱取 Tris0.303g 、 SDS0.8g 、溴酚

10、藍(lán) 0.189g ,溶于 2ml 注射用 水中,加入甘油 4ml ,濃 HCl0.189ml ,加注射用水定容至 10ml ,二人復(fù)核,貼簽, 標(biāo)明溶液的名稱、濃度、體積、批號(hào)、配制日期, 4冰箱放置。 4貯存。2. 1. 5樣品準(zhǔn)備:將樣品自冰箱內(nèi)拿出,放置室溫融化后,將樣品與樣品處 理液按 3:1(V/V的比例混勻,沸水處理 35分鐘,待用。2. 2操作過(guò)程2. 2. 1. 1分離膠(13.5%制備聚丙烯酰胺膠母液 14.4ml, 分離膠緩沖液 8ml, 1%SDS 3.2ml ,注射用水 3.2ml,1%過(guò)硫酸銨 1.6ml , 1%TEMED1.6ml,制成膠量 32ml 。2. 2.

11、 1. 2濃縮膠 (4.5%的制備聚丙烯酰胺凝膠母液 2.4ml, 濃縮膠緩沖液 4ml, 注射用水 4.8ml , 1%SDS 1.6ml ,1%過(guò)硫酸銨 1.6ml , 1%TEMED1.6ml, pH6.8,成膠量 16ml 。2. 2. 1. 3灌膠灌膠時(shí)先將電泳槽陽(yáng)極側(cè)用透析紙包上,在電泳槽內(nèi)加滿水,靠水壓封住陽(yáng)極 側(cè)縫隙,以免膠溶液漏出;在兩玻璃板間加分離膠,加膠完畢后,用注射器沿玻璃 板在液面上覆蓋一層(約 0.3cm 高正丁醇;待膠凝固后,將電泳槽內(nèi)注射用水及膠表面的正丁醇倒掉,并用濾紙吸干;向電泳槽內(nèi)加入電極緩沖液、在濃縮膠位置 插上梳子,在分離膠上加濃縮膠,待膠凝固后抽去梳

12、子。2. 2. 2加樣 :將處理后樣品按每孔不少于 5ug 的蛋白量,加入樣品槽內(nèi) . 2. 2. 3電泳 : 打開(kāi)電泳儀,摘下“備用”標(biāo)志牌,掛“運(yùn)行”標(biāo)志牌,調(diào)定 電流,起始電流 15mA ,待指示線跑至分離膠處,改電流為 25 mA ,電泳時(shí)間約為 2.5小時(shí),待指示劑至底線處 , 停止電泳 , 關(guān)閉電泳儀,摘下“運(yùn)行”標(biāo)志牌 , 掛“備用” 標(biāo)志牌 。2. 2. 4染色電泳完畢后取下膠片, 置于 5倍膠體積的固定液內(nèi) 12h (或室溫振蕩 30分鐘 ; 洗液洗三次,每次 10分鐘, 37搖床內(nèi)振蕩;取 5ml 重鉻酸鉀母液加入 200ml 注射 用水中,將膠片置其中 , 避光 , 振蕩

13、 10分鐘;用注射用水洗數(shù)次至黃色本底變白; 加 入新配制的 0.2 %AgNO3溶液白熾燈下照射 30分鐘;水洗五次;顯色液 500ml 中加甲 醛 0.35ml ,待樣品蛋白帶及分子量蛋白帶清晰后棄去顯色液加入終止液。2. 2. 5掃描2. 2. 5. 1打開(kāi)掃描儀 , 摘下“備用”標(biāo)志牌 , 掛上“運(yùn)行”標(biāo)志牌。2. 2. 5. 2對(duì)膠片進(jìn)行掃描 , 同時(shí)記錄下掃描結(jié)果。2. 2. 5. 3關(guān)閉掃描儀 , 摘下“運(yùn)行”標(biāo)志牌 , 掛“備用”標(biāo)志牌。2. 2. 6摘下場(chǎng)地“使用中”標(biāo)志牌 , 掛“待處理”標(biāo)志牌。3 結(jié)果判定3. 1判定標(biāo)準(zhǔn) :染色后膠片經(jīng)掃描儀掃描, 樣品蛋白帶含量應(yīng)在

14、95%以上, 二聚體量不超過(guò) 5%。3. 2判定結(jié)果填寫(xiě)記錄。4 清場(chǎng)4. 1需要低溫貯存的液體放入冰箱,避光的液體放入陰暗處。4. 2稱藥之后將藥品瓶蓋蓋緊,放回藥品柜。4. 3關(guān)閉扭力天平,清潔干凈后放回原處,掛“備用”標(biāo)志牌。4. 4清潔工作臺(tái)面,用專用抹布擦凈,地面用專用拖布拖凈。4. 5用過(guò)的玻璃器皿用純化水沖洗干凈后返回洗刷組。4. 6填寫(xiě)清場(chǎng)記錄。47 清場(chǎng)后由車(chē)間工序負(fù)責(zé)人或質(zhì)量監(jiān)督員檢查合格后,摘下“待處理”標(biāo)志 牌,掛“清場(chǎng)合格”標(biāo)志牌。 5 注意事項(xiàng) 51 本實(shí)驗(yàn)所用 SDS 需高純度 SDS,如不純需重結(jié)晶。 52 樣品必須經(jīng)沸水處理 3-5 分鐘,以免有亞穩(wěn)聚合物存在。 附:SDS-PAGE(快速電泳 準(zhǔn)備工作同前。 1 制膠 11 分離膠制備：（13.5%） 聚丙烯酰胺凝膠母液 7.2ml, 分離膠緩沖液 4ml, 1%SDS 3.2ml， 注射用水 1.6ml， 1%過(guò)硫酸銨 0.8ml，1%TEMED0.8ml，制成膠量 16ml。 12 濃縮膠的制備(4.5% 聚丙烯酰胺凝膠母液 1.2ml, 濃縮膠緩沖液 2ml,注射用水 2.4ml，1%SDS 0.8ml， 1%過(guò)硫酸銨 0.8ml，1%TEMED0.8ml， pH6.8，成