紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

1、教材1 紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?#216; 學(xué)習(xí)紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理;Ø 掌握紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的實(shí)驗(yàn)技術(shù); Ø 掌握TU-1901紫外-可見分光光度計(jì)的使用方法并了解此儀器的主要構(gòu)造。二、實(shí)驗(yàn)原理 紫外-可見吸收光譜法又稱紫外-可見分光光度法,它是研究分子吸收190nm750nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜，是以溶液中物質(zhì)分子對(duì)光的選擇性吸收為基礎(chǔ)而建立起來的一類分析方法。紫外-可見吸收光譜的產(chǎn)生是由于分子的外層價(jià)電子躍遷的結(jié)果，其吸收光譜為分子光譜，是帶光譜。 進(jìn)行定性:利用紫外-可見吸收光譜法進(jìn)行定性分析一般采用光譜比較法。即將未知純

2、化合物的吸收光譜特征，如吸收峰的數(shù)目、位置、相對(duì)強(qiáng)度以及吸收峰的形狀與已知純化合物的吸收光譜進(jìn)行比較。 定量分析: 紫外-可見吸收光譜法進(jìn)行定量分析的依據(jù)是朗伯-比爾定律：A=lgI0/I=bc，當(dāng)入射光波長(zhǎng)及光程b一定時(shí)，在一定濃度范圍內(nèi)，有色物質(zhì)的吸光度A與該物質(zhì)的濃度c成正比，即物質(zhì)在一定波長(zhǎng)處的吸光度與它的濃度成線形關(guān)系。因此，通過測(cè)定溶液對(duì)一定波長(zhǎng)入射光的吸光度，就可求出溶液中物質(zhì)濃度和含量。由于最大吸收波長(zhǎng)max處的摩爾吸收系數(shù)最大，通常都是測(cè)量max的吸光度，以獲得最大靈敏度。光度分析時(shí)，分別將空白溶液和待測(cè)溶液裝入厚度為b的兩個(gè)吸收池中，讓一束一定波長(zhǎng)的平行單色光非別照射空白和

3、待測(cè)溶液，以通過空白溶液的透光強(qiáng)度為I0，通過待測(cè)溶液的透光強(qiáng)度為I，根據(jù)上式，由儀器直接給出I0與I之比的對(duì)數(shù)值即吸光度。紫外-可見分光光度計(jì):紫外-可見吸收光譜法所采用的儀器稱為分光光度計(jì)，它的主要部件有五個(gè)部分組成，即由光源發(fā)出的復(fù)合光經(jīng)過單色器分光后即可獲得任一所需波長(zhǎng)的平行單色光,該單色光通過樣品池靜樣品溶液吸收后，通過光照到光電管或光電倍增管等檢測(cè)器上產(chǎn)生光電流，產(chǎn)生的光電流由信號(hào)顯示器直接讀出吸光度A?？梢姽鈪^(qū)采用鎢燈光源、玻璃吸收池;紫外光區(qū)采用氘燈光源、石英吸收池。 本實(shí)驗(yàn)采用紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此，蛋白質(zhì)具有吸收紫外

4、光的性質(zhì)，其最大吸收峰位于280 nm附近（不同的蛋白質(zhì)吸收波長(zhǎng)略有差別）。在最大吸收波長(zhǎng)處，吸光度與蛋白質(zhì)溶液的濃度的關(guān)系服從朗伯-比耳定律。該測(cè)定法具有簡(jiǎn)單靈敏快速高選擇性，且穩(wěn)定性好，干擾易消除不消耗樣品，低濃度的鹽類不干擾測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)。 特點(diǎn)：帶光譜 分子光譜 應(yīng)用：定性分析-最大吸收波長(zhǎng) 定量分析-朗伯-比爾定律（標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法） 根據(jù)朗伯比耳定律：A=bc，只要繪出以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度c為橫坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)出試液的吸光度，就可以由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得對(duì)應(yīng)的濃度值，即未知樣的含量。三、儀器與試劑TU-1901紫外-可見分光光度計(jì)，比色管，吸量管標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：5.00 mg.mL

5、-1溶液0.9% NaCl溶液，待測(cè)蛋白質(zhì)溶液四、實(shí)驗(yàn)步驟 一準(zhǔn)備工作1. 啟動(dòng)計(jì)算機(jī)，打開主機(jī)電源開關(guān)，啟動(dòng)工作站并初始化儀器。 2. 在工作界面上選擇測(cè)量項(xiàng)目（光譜掃描，光度測(cè)量），本實(shí)驗(yàn)選擇光度測(cè)量，設(shè)置測(cè)量條件（測(cè)量波長(zhǎng)等）。 3. 將空白放入測(cè)量池中，點(diǎn)擊START掃描空白，點(diǎn)擊ZERO校零。4. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。 二測(cè)量工作 1.吸收曲線的繪制: 用吸量管吸取2mL5.00mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于10mL比色管中，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻 度，搖勻。用1cm石英比色皿，以0.9% NaCl溶液為參比，在190 nm400nm區(qū)間，測(cè)量吸光度。 2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 ： 用

6、吸量管分別吸取0.5、1.0 、1.5、 2.0 、2.5 mL 5.00 mg.mL-1標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻度，搖勻。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液為參比，在280 nm處分別測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度A278記錄所得讀數(shù)。 3. 樣品測(cè)定： 取適量濃度的待測(cè)蛋白質(zhì)溶液3 mL，按上述方法測(cè)定278 nm處的吸光度。平 行測(cè)定三份。五、數(shù)據(jù)處理：1. 以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制吸收曲線，找出最大吸收波長(zhǎng)。 由吸收曲線可得最大吸收波長(zhǎng)max=278nm(圖略)2. 以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

7、。 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C(mg/mL)吸光度A0.250.1710.500.3350.750.4821.000.6371.250.796 濃度C-吸光度A標(biāo)準(zhǔn)曲線方程是：A=0.6208*C+0.0186 曲線擬合優(yōu)度: R2=0.9998 3. 根據(jù)樣品蛋白質(zhì)溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測(cè)蛋白質(zhì)的濃度。平行測(cè)定次數(shù)樣品液吸光度A樣品溶液濃度C(mg/mL)10.6761.05920.6721.05330.6741.056所測(cè)溶液平均濃度: C=(C1+C2+C3)/3=1.056 mg/mL測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差： =0.003相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差： =0.284% 待測(cè)蛋白質(zhì)溶液濃度為：1.056 mg/mL*10mL/3mL=3.520 mg/mL。六、思考題:紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有何優(yōu)缺點(diǎn)？受哪些因素的影響和限制？?jī)?yōu)點(diǎn)：該測(cè)定法具有簡(jiǎn)單靈敏快速高選擇性，且穩(wěn)定性好，干擾易消除不消耗樣品，低濃度的鹽類不干擾測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)：儀器昂貴，而