真菌檢測方法

1、分離培養(yǎng)：無菌采取病料接種馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基中，置37 C恒溫箱中培養(yǎng)24小時，長成絨毛樣菌絲，未見其它細(xì)菌生長。經(jīng) 48小時培養(yǎng)長成白色菌落。72小時菌落呈紐扣狀，由中心向外周逐漸變深，轉(zhuǎn)變成灰白色、灰綠色。取培養(yǎng)物鏡檢可見大量球形的分生孢子。通常人們把真菌和霉菌認(rèn)為是一種病原的兩種說法。真正真菌包括霉菌，霉菌只是眾多真菌中的一種。真菌是由單細(xì)胞或多細(xì)胞組成，按有性或無性方式進(jìn)行繁殖的真核細(xì)胞類微生物。根據(jù)其侵犯人體的部位 分為前部真菌和深部通常人們把真菌和霉菌認(rèn)為是一種病原的兩種說法。真正真菌包括霉菌，霉菌只是眾 多真菌中的一種。真菌是由單細(xì)胞或多細(xì)胞組成，按有性或無性方式進(jìn)行繁殖的真核細(xì)胞

2、類微生物。根據(jù) 其侵犯人體的部位分為前部真菌和深部真菌，包括皮膚癬菌、孢子絲菌、念珠菌、曲霉菌、隱球菌、組織 胞漿菌等。而霉菌多為細(xì)胞真菌的一種，也為深部感染真菌，包括煙曲菌、黃曲菌、黑曲菌、土曲菌等， 常發(fā)生于免疫力低下的患者，引起全身播散性感然，影響預(yù)后。培養(yǎng)基的選擇應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料和檢驗(yàn)?zāi)康膩泶_定。目前國標(biāo)方法中使用的培養(yǎng)基有：馬鈴署葡萄糖瓊脂（PDA）,孟加拉培養(yǎng)基（RBC）、高鹽察氏培養(yǎng)基（CAO）,其中PDA和RBC適合于一般的霉菌和酵母菌生長，而CAO則適合于高滲性霉菌生長，酵母菌幾乎不長。在日常檢測中我們發(fā)現(xiàn)，有些常見的耐高滲性霉菌，如局限 曲霉、謝瓦曲霉、赤曲霉、Wallemi

3、a等在PDA、RBC上生長非常緩慢或不長，而這些菌在高滲培養(yǎng)基如 M40Y、 DG18（M40Y瓊脂配方：蔗糖400g,麥芽提取汁20g,酵母提取汁5g,瓊脂20g,氯霉素50mg,蒸餾水 1000ml;DG18 瓊脂配方:葡萄糖 10g,蛋白胨 5g,KH2PO41g,MgSO4 7H2O 0.5g,氯霉素 0.1g,0.2% 二氯硝基 苯胺1.0mL,瓊脂15g,蒸餾水1000mL,PH6.5）上則正常生長，孢子、形態(tài)特征發(fā)育良好，而且酵母菌也能在 M40Y、DG18上生長，因此,若能同時采用 PDA和M40Y（或DG18）分離培養(yǎng)各類樣品中的霉菌 ，將能更全面 地反映出污染霉菌的菌相。特

4、別是對干燥食品、高糖食品、淹漬食品等，更有必要同時采用 M40Y或DG18。由于霉菌中很多種類不會產(chǎn)生有毒的霉菌毒素，危害較小，而有的菌株即使污染數(shù)量不多，但其產(chǎn)生的霉菌毒素卻危害較大，因此僅作霉菌計(jì)數(shù)并不能全面反映其危害程度，重要的是要知道污染菌的菌相，才能更好地判斷被污染食品的安全程度。為此，國外有些研究者設(shè)計(jì)出各類選擇性培養(yǎng)基，可以識別產(chǎn)毒的霉菌。如AFPA培養(yǎng)基（配方：酵母提取汁20g,蛋白胨10g,檸檬酸鐵銨0.5g,0.2%二氯硝基苯胺1.0mL,瓊脂 15g,蒸餾水1000mL,PH5.6）用于分離黃曲霉毒素產(chǎn)生菌高污染率的食品。產(chǎn)黃曲霉毒素的菌株黃曲霉和寄生曲霉在AFPA上30

5、 C培養(yǎng)23天就形成背面有亮橙黃色的特征性菌落，非常容易識別。有人利用該培養(yǎng)基分離黃曲霉高污染食品花生、玉米等，取得了滿意的結(jié)果。因此，針對不同樣品，有目的地設(shè)計(jì)出相應(yīng)的選擇性培養(yǎng)基，以篩選污染菌中的危險(xiǎn)菌群，將是一個值得探索的方向。2接種方式接種方式主要有傾注法和涂布法兩種。目前國際方法中采用傾注法 ，但近來國際上有不少學(xué)者認(rèn)為霉菌計(jì)數(shù)采用涂布法更合適。Beuchat和Matsuda等人分別對這兩種方法作了大量比較試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，對霉菌計(jì)數(shù)來說,涂抹法有以下幾方面優(yōu)越于傾注法：培養(yǎng)出的霉菌菌落數(shù)較多；培養(yǎng)所需的時間較短；霉菌孢子、菌落形態(tài)特征發(fā)育完全，便于鑒定。這是因?yàn)榻^大多數(shù)霉菌是好氧的，在培

6、養(yǎng)基表面生長快，發(fā)育好，而混在培養(yǎng)基中發(fā)育就受影響，而且在培養(yǎng)基傾注時霉菌孢子易受熱損傷。我們在自己的實(shí)驗(yàn)室也做了類似的比較試驗(yàn)，通過對30種常見霉菌的試驗(yàn)證實(shí)了上述的結(jié)論。因此，我們認(rèn)為，霉菌計(jì)數(shù)采用涂布法既準(zhǔn)確又省時,值得推廣。3培養(yǎng)溫度經(jīng)對多種常見霉菌的最適生長溫度作了調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大部分菌種的最適溫度為2530 C。但一些產(chǎn)曲霉毒素的菌株或動物致病菌則需要更高的溫度，如黃曲霉35C、構(gòu)巢曲霉33C、煙曲霉37 C、小孢子菌35 C。因此,培養(yǎng)溫度也應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)目的而定，一般情況下都采用 2528 C培養(yǎng),若有特殊培養(yǎng)目的，則應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度。4培養(yǎng)時間我們對30種常見霉菌的生長速度作了調(diào)查

7、，正常培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)34天的菌落數(shù)與57天的基本相同，但菌種的特征不明顯，因此，如果只要作霉菌計(jì)數(shù)，培養(yǎng)34天已基本達(dá)到目的，但如果還要進(jìn)一步分 類鑒定，則需要培養(yǎng)更長的時間（714天）。必須特別注意的是，有幾類生長特別快、菌絲很多的菌，則必需在 48小時以內(nèi)計(jì)數(shù)，否則菌絲就會覆蓋整個平皿，無法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。這類菌主要有：毛霉、根霉、犁頭霉、共頭霉、 木霉等濕度較大的樣品，這類菌污染較多，檢測這類樣品，應(yīng)提早觀察記錄。5最適計(jì)數(shù)范圍霉菌菌落由孢子和菌絲組成，相當(dāng)擴(kuò)散，在直徑9cm的平皿里，菌落數(shù)稍多就相互交叉重疊，影響計(jì)數(shù)，但 數(shù)量太少又會產(chǎn)生較大的誤差，因此選擇適當(dāng)?shù)南♂尪扔?jì)數(shù)是保證結(jié)果準(zhǔn)確的

8、關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。我們對這方面作了一些觀察研究，首先是將實(shí)驗(yàn)菌株的斜面培養(yǎng)物制成含有約106個/ml的孢子懸液，并用血球計(jì)數(shù)器在顯微鏡下準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，然后將飽子懸液作10-110-6倍稀釋，吸取不同稀釋度的稀釋液接種于PDA，25 C培養(yǎng)5天后計(jì)數(shù)。30種常見霉菌的兩種不同計(jì)數(shù)方法所得結(jié)果比較顯示，大部分菌株每平板含有1050個菌落的稀釋度時的計(jì)數(shù)與顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果最接近；有近一半的菌株，每個平板含50100個菌落已較難計(jì)數(shù)，而大部分菌株,超過100個/平皿或小于10個/平皿的計(jì)數(shù)結(jié)果就與顯微計(jì)數(shù)結(jié)果存在較大差別，因此，應(yīng)盡量選擇1050個/平皿的稀釋度進(jìn)行霉菌計(jì)數(shù)。而對上述提及的菌絲很豐富、菌落特別擴(kuò)

9、散的毛霉、根霉、犁頭 霉等菌株，則應(yīng)在更少的范圍內(nèi)計(jì)數(shù)（30個/平皿以內(nèi)）。為控制霉菌的生長速度和菌落的生長范圍，可在培養(yǎng)基中添加少量抗生素 ，如氯霉素（50100mg/L）, 金霉素（20100mg/L）, 慶大霉素（50mg/L）, 土霉素（100mg/L）6霉菌檢測過程中應(yīng)特別注意的事項(xiàng)6.1由于霉菌檢測所需的時間較長，中間又需要多次觀察，因此實(shí)驗(yàn)前一定要作好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，明確觀察 記錄的時間。6.2 霉菌孢子通過空氣傳播，所以實(shí)驗(yàn)時應(yīng)保持實(shí)驗(yàn)室平靜，減少空氣流通；操作時手腳要快，動作要輕,特別是培養(yǎng)過程中，如果觀察時動作過大，早期生長出的霉菌孢子就會在培養(yǎng)基內(nèi)擴(kuò)散，形成新的菌落，導(dǎo)致結(jié)果不

10、準(zhǔn)確。6.3 實(shí)驗(yàn)前應(yīng)認(rèn)真做好全面的消毒工作，包括操作人員手指、實(shí)驗(yàn)室空間、實(shí)驗(yàn)臺等，實(shí)驗(yàn)后應(yīng)第一時間將有霉菌的培養(yǎng)物高壓滅菌，防止進(jìn)一步擴(kuò)散。6.4 對使用的菌株的生理、生態(tài)、形態(tài)、毒理、致病性必需有充分的了解，并作好相應(yīng)的防擴(kuò)措施，防止污染其它物品。氣囊上的涂片鏡檢分別取15羽雞肺部或氣囊有結(jié)節(jié) 的病料，將結(jié)節(jié)用2片載玻片壓碎后分開，再用鑷子 調(diào)勻，革蘭氏染色后蓋上蓋玻片，置高倍鏡下觀察。 結(jié)果在暗視野下可見到大量的分隔菌絲，結(jié)節(jié)除可見到菌絲外，還可以見到散在的藍(lán)色球狀孢子。3.2.2分離培養(yǎng)挑取典型病變結(jié)節(jié)接種于血液瓊脂平板培養(yǎng)基上，置于37 C溫箱中培養(yǎng)。24 h后可見到小米粒大小的白

11、色絨毛狀菌落，48 h后菌落增大，60 h后轉(zhuǎn)為淡綠色，72 h后菌落轉(zhuǎn)為暗綠色，一 個星期后呈黑褐色4。用接種環(huán)挑取菌落涂片鏡檢， 可見到曲霉菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)（菌絲有隔，末端膨大成球 狀，球上有小梗，有的梗上有孢子存在，狀如花冠），符合曲霉菌的特點(diǎn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果再結(jié)合病史調(diào)查、現(xiàn)場觀察、臨床癥狀及剖檢變化，可確診為禽曲霉菌病。（一）直接檢查 是最簡單而重要方法，淺部感染真菌的病變標(biāo)本如毛發(fā)、皮屑、甲屑置玻片上，滴 加10%KOH，覆蓋玻片微熱熔化角質(zhì)層，再將玻片壓緊，用吸水紙吸去周圍多余堿液，在顯微鏡下觀察， 見皮屑甲屑中有菌絲，或毛發(fā)內(nèi)部或外部有成串孢子，即可初步診斷為癬菌感染，但不能確

12、定菌種。深部 感染真菌標(biāo)本如痰，腦脊液亦可做涂片用革蘭氏染色（白色念珠菌）或愚汁負(fù)染色（隱球菌）觀察形態(tài)特 征。（二）培養(yǎng)檢查 本法可確定菌種，輔助直接檢查不足，通常用沙保氏培養(yǎng)基（2228 C）,深部真菌可用血瓊脂或腦心葡萄糖血瓊脂37C培養(yǎng)，或根據(jù)不同菌種運(yùn)用不同培養(yǎng)基，如孢子絲菌可用胱氨酸血液葡萄糖瓊脂，必要時運(yùn)用鑒別培養(yǎng)基和生化反應(yīng)，同化試驗(yàn)等進(jìn)行鑒定。（三）免疫學(xué)試驗(yàn) 近年來有許多方法用于檢測深部感染真菌的抗體，作輔助診斷莢膜組織胞漿菌、念珠菌、曲霉菌。但系統(tǒng)性感染患 者常因免疫功能降低不出現(xiàn)抗體；而且許多真菌間抗原性有交叉反應(yīng)；有的產(chǎn)生抗體后維護(hù)時間較長，正 常人群中有一定比例的陽

13、性率，則必須結(jié)合臨床情況分析結(jié)果才能作出恰當(dāng)?shù)脑\斷。由于上述檢測抗體受到許多因素的限制，及深部真菌感染時，早期培養(yǎng)陽性率甚低，晚期則多于失去治療時機(jī)，因此用免疫 學(xué)方法從血清或其他部位檢測真菌抗原，對早期診斷具有重要意義。如乳膠凝集法檢測新型隱球菌病患者 的莢膜多糖抗原，ELISA法檢測白色念珠菌感染者的甘露聚糖抗原及免疫熒光法檢測孢子絲菌病患者的可 溶性抗原等，均為早期，快速、特異的診斷方法。（四）動物試驗(yàn) 其些真菌對實(shí)驗(yàn)動物有致病性，如皮炎芽生菌，球孢子菌可在小白鼠，豚鼠體內(nèi)生長，白色念珠接種家兔小白鼠可發(fā)生腎臟膿腫致死。四、防治原則 真菌感染尚無特異預(yù)防，主要注意公共衛(wèi)生和個人衛(wèi)生，碘化

14、物治療孢子絲菌病、毛霉菌病有 一定療效。制霉素、灰黃霉素、克霉唑（三苯甲霉唑）等外用或內(nèi)服過癬癥和白色念珠菌病等有較好療效。 近年服道5-氟胞嘧啶（5-FC ）治療單細(xì)胞真菌感染療效顯著。二性霉素B可用于深部全身真菌感染。玻片培養(yǎng)又稱小培養(yǎng)，小培養(yǎng)法可以隨時觀察真菌的生長形態(tài)（如大分生孢子、小分生孢子及孢子柄 等）,還可以隨時觀察其生長發(fā)育的全部情況，有利于菌種的鑒定。？1、鋼環(huán)法？（1）材料：白假絲酵母菌、沙保弱培養(yǎng)基、玻片培養(yǎng)又稱小培養(yǎng)，小培養(yǎng)法可以隨時觀察真菌的生 長形態(tài)（如大分生孢子、小分生孢子及孢子柄等），還可以隨時觀察其生長發(fā)育的全部情況，有利于菌種 的鑒定。？1、鋼環(huán)法？（1）

15、材料：白假絲酵母菌、沙保弱培養(yǎng)基、無菌玻片、蓋玻片、鋼環(huán)（帶有缺口）、石蠟。？（2）方法？ 用無菌鑷子取無菌小培養(yǎng)鋼環(huán)，環(huán)的兩面分別蘸取熔化的固體石蠟，平置于無菌載玻片上，另取一無菌蓋玻片，在酒精燈火焰上加熱后覆蓋于鋼環(huán)上，待冷后，小培養(yǎng)鋼圈即被固定于載玻片與蓋玻片之間。 用毛細(xì)滴管吸取融化的培養(yǎng)基，從鋼環(huán)上端孔注入，注入量占容積的1/2即可。？ 培養(yǎng)基冷卻凝固后，用接種針挑取材料，由上端孔接種于環(huán)內(nèi)培養(yǎng)基上。？ 置濕盒內(nèi)，室溫或 37 C下培養(yǎng)2 3d后，逐日觀察，鏡下可連續(xù)看到真菌生長過程及菌絲、孢子等 特征，一般7d左右即可長好。？ 也可不用小培養(yǎng)鋼環(huán)，直接將融化的培養(yǎng)基滴于無菌玻片上，

16、待冷凝后從周邊接種材料，用蓋玻片覆蓋后培養(yǎng)，在顯微鏡下連續(xù)觀察生長情況。？（3 ）結(jié)果：鏡下觀察可見到有胞壁增厚的厚膜孢子及假菌絲。？2、小塊瓊脂玻片培養(yǎng)法 ？用無菌操作法將制好的待用瓊脂平板用無菌接種針或接種環(huán)切成大約1cm2的方塊，將其放置于滅菌的載玻片上。將標(biāo)本或待檢菌接種于瓊脂塊四周邊緣靠上方部位，然后用無菌鑷子取一無菌的蓋玻片蓋在 瓊脂上。在無菌平皿內(nèi)放入少量無菌水和一個無菌U形（或V形）玻璃棒。將此載玻片置于玻璃棒上，蓋上平皿蓋培養(yǎng)。每日用肉眼和顯微鏡觀察孢子和菌絲的特點(diǎn)。涂片找真菌標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程?1檢驗(yàn)?zāi)康模河酶锾m染色找酵母樣菌，為臨床感染的初步診斷和用藥提供依據(jù)。2適用范圍：各種

17、涂片標(biāo)本（主要如白帶等）3檢驗(yàn)原理3.1真菌的染色結(jié)構(gòu)如革蘭陽性菌細(xì)胞壁。3.2經(jīng)過革蘭染色后變成紫色，體形較細(xì)菌大容1檢驗(yàn)?zāi)康模河酶锾m染色找酵母樣菌，為臨床感染的初步診斷和用藥提供依據(jù)。2適用范圍：各種涂片標(biāo)本（主要如白帶等）3檢驗(yàn)原理3.1真菌的染色結(jié)構(gòu)如革蘭陽性菌細(xì)胞壁。3.2經(jīng)過革蘭染色后變成紫色，體形較細(xì)菌大容易辨認(rèn)。4試劑：4.1試劑廠家：珠海貝索生物科技公司4.2包裝規(guī)格：250ml X 44.3試劑盒組成沙黃溶液（沙黃、乙醇）5儀器設(shè)備：奧林巴斯雙目顯微鏡6操作程序6.1涂片：用無菌接種環(huán)取一環(huán)無菌生理鹽水于玻片上，再用無菌接種環(huán)挑取所需菌落，在玻片的生 理鹽水上均勻涂抹，自然

18、晾干。6.2固定：6.3將龍膽紫液（Crystal Violet）滴加在已固定的涂片上，染10秒鐘后，水洗并甩干。6.4滴加碘溶液（lodine Solution）, 10秒鐘后水洗并甩干6.5再滴加脫色液(Decolorizer )，脫色10- 20秒(或搖動玻片至紫色不再脫落為止，根據(jù)涂片之 厚薄之需要)，水洗并甩干。6.6加沙黃溶液(Safranin Solution)復(fù)染10秒之后水洗。6.7以濾紙吸干或在空氣中自然干后，油鏡鏡檢。7結(jié)果觀察7.1有真菌孢子及菌絲出現(xiàn)報(bào)告：找到真菌。7.2無真菌孢子及菌絲出現(xiàn)報(bào)告：未找到真菌。8質(zhì)量控制：大腸埃希菌呈 G-桿菌；金黃色葡萄球菌呈G+球菌

19、。9注意事項(xiàng)9.1涂片不能太厚，并且要均勻，否則菌體堆積或分散不勻，會影響染色結(jié)果。9.2脫色要至無藍(lán)色脫落為止。9.3火焰固定時，應(yīng)避免菌體過分受熱而皺縮變形，影響結(jié)果的判斷。9.4每次染色時應(yīng)用大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌作陰陽性質(zhì)控對照。10臨床意義：輔助臨床判斷是否是藥物引起的菌群失調(diào)或真菌感染。11支持文件：全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程(第三版)表3鼻咽喉標(biāo)本標(biāo)本類型采集時間和溫度重復(fù)采樣限制說明原則裝置和最小量轉(zhuǎn)運(yùn)儲存鼻用預(yù)先被無菌 鹽水濕潤的拭子插 入鼻孔約2cm,對著 鼻粘膜用力旋轉(zhuǎn)，蘸 取粘膜上分泌物，緩 慢抽岀，將拭子直接 送檢。拭子轉(zhuǎn)運(yùn)2h,常溫24h,常溫1/d喉用壓舌板壓舌，

20、用無菌拭子從咽后、 扁桃體和發(fā)炎區(qū)域 采樣，不要碰觸舌頭 和面頰。拭子轉(zhuǎn)運(yùn)2h,常溫24h,常溫1/d喉拭子培養(yǎng)不能用于會厭發(fā)炎的患者。主要病原菌：A群B溶血鏈球菌可選擇性報(bào)告：溶血隱秘桿菌表6糞便采集時間和溫度重標(biāo)本類型原則裝置轉(zhuǎn)運(yùn)儲存復(fù)采樣說明和限制最小量常規(guī)直接置入一無菌 1h,常溫1/d住院時間超過3 d培養(yǎng)清潔、廣口的無菌容器2g或入院診斷不是胃腸炎容器或者的患者不做常規(guī)糞便培1.5ml養(yǎng)。對這些患者應(yīng)進(jìn)行梭狀芽抱桿菌的培養(yǎng)或毒素檢測。梭狀芽將液體或軟無菌4 C,次的患者。內(nèi)。1.5ml24h,-20 C3 d ,-20 C冷凍易于使4 C 或-70 C細(xì)胞毒素快速丟失。更長用于毒素檢測E. coli將液體或血無菌 1h,常溫24h,1/d有腹部痙攣的患者O157:H便放入一清潔、干容器2g4 C在發(fā)病6小時內(nèi)采集到燥的容器或2ml的血或液狀便效果更好直腸拭子1.小心插入拭子 1h