一株產(chǎn)慶大霉素C1a的工程菌及其應用剖析

1、一株產(chǎn)慶大霉素C1a的工程菌及其應用 WO 2013060073 A1摘要提供了一種滅活gntK功能的產(chǎn)慶大霉素C1a的工程菌及其應用，其中，工程菌為絳紅色小單孢菌GK1101，已于2011年9月13日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC No.5245。該工程菌能夠用于制備抗菌藥物。權利要求(1)1.1. 一株產(chǎn)慶大霉素 Cla工程菌， 其特征在于， 所述工程菌為滅活 功能的絳紅色小單孢 飄 Micwmonospom purpurea) GK1101 , 已于 2011年 9月 13日在中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心登記保藏， 保

2、藏編號為 CGMCC No. 5245 2.2. 種如權利要求 1所述的工程菌的發(fā)酵方法， 其特征在于， 菌株 GK1101發(fā)酵前先用稀釋 平板法分離出產(chǎn)孢豐富的單菌落后， 再轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基， 37°C培養(yǎng) 10天， 挖塊接種于種子 培養(yǎng)基， 37°C搖床培養(yǎng) 28 h， 轉(zhuǎn)速為 280rpm， 然后按 10%接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基， 37°C搖 床培養(yǎng) 124 h， 轉(zhuǎn)速為 280rpm; 所述種子培養(yǎng)基： 葡萄糖 0.1-1.0%， 玉米淀粉 1.0-2.0%， 玉 米粉 0.5-2.5%， 蛋白胨 0.1-0.8%， 黃豆餅粉 0.5-1.5%， KN03

3、 0.05-0.10% , CaC03 0.1-0.5%, .5-7.5, 發(fā)酵培養(yǎng)基： 玉米淀粉 3.0-6.0% , 玉米粉 1.0-2.0% , 蛋白胨 0.1-0.8% , 黃豆餅粉 1.0-4.0 % , KN03 0.01-0.10% , (NH4)2S040.1-0.5% , CaC03 0.1-0.5%, 淀粉酶 0.001-0.025%， 6·5-7·5。3.3. 如權利要求 1所述的工程菌在制備抗菌藥物中的應用。4.說明一株產(chǎn)慶大霉素 Cla的工程菌及其應用 技術領域本發(fā)明屬于抗生素制藥領域， 涉及一種工程菌的構(gòu)建

4、及其應用， 具體地說， 本發(fā)明涉及 一株產(chǎn)慶大霉素 Cla工程菌， 應用于抗生素制造。背景技術小單孢菌可產(chǎn)生豐富的次級代謝產(chǎn)物， 特別是氨基糖苷類抗生素， 如慶大霉素、 西索米 星和福提米星等。 這些小單孢菌分布奇特， 生長緩慢且細胞壁結(jié)構(gòu)特殊， 故研究進展緩慢。 此外， 由于缺乏通用的基因操作系統(tǒng)， 小單孢菌遺傳操作困難， 使得對其分子生物學的研究 也大大落后于鏈霉菌。小單孢菌是慶大霉素產(chǎn)生菌， 慶大霉素是氨基糖苷類抗生素， 已在臨床上應用了近半個 世紀， 是我國、 乃至全世界抗感染必備的基本藥物。 慶大霉素屬多組分代謝產(chǎn)物， 起抗菌作 用的主要組分為 C族復合物： Cl、 C2和 Cla。

5、慶大霉素產(chǎn)生菌代謝產(chǎn)物可開發(fā)的組分十分豐 富， 如慶大霉素 Cla是合成抗耐藥菌藥物依替米星 （Etimicin) 的前體； 慶大霉素 B是進一 步合成抗耐藥菌藥物異帕米星的母體； 慶大霉素 、 B、 X是進一步開發(fā)抗原蟲的良好藥物； 最新研究發(fā)現(xiàn)氨基糖苷類抗生素還具有抗 HIV等功效。 因此對該類稀有藥用微生物進行深入 研究， 特別是分子遺傳學方面的研究， 具有極大意義。盡管人們對小單孢菌和慶大霉素的研究已近五十年， 也取得了一些可喜的成果， 但一直 未有重大的突破。 青霉素在五十余年的研究開發(fā)過程中， 效價提高了近萬倍， 而慶大霉素僅 提高了幾十倍， 差別非常懸殊。 二十世紀八十年代興起的

6、鏈霉菌基因工程， 已在抗生素生物 合成基因的克隆、 產(chǎn)量提高、 組分改善及雜合抗生素生產(chǎn)等方面取得了一定的進展， 但在小 單孢菌中的應用進展緩慢。依替米星是新型半合成慶大霉素， 是中國獨創(chuàng)的抗生素一類新藥， 已在多國申請專利， 其知識產(chǎn)權得到了有效保護， 需求量大， 是本類抗生素臨床首選藥物。但由于合成依替米星的母體是慶大霉素 Cla (圖 1 )。 而慶大霉素 Cla需要從慶大霉素產(chǎn) 生菌的代謝產(chǎn)物中分離才能得到。 不幸的是， 到目前為止， 所有慶大霉素產(chǎn)生菌的代謝產(chǎn)物 是復合物， 主要包括慶大霉素 Cl、 C2和 Cla等。 這些復合物化學結(jié)構(gòu)相近， 理化性質(zhì)相似， 從中分離單組份慶大霉素

7、 Cla非常困難，導致慶大霉素 Cla供不應求，且生產(chǎn)成本居高不下， 層析分離周期長， 收率低， 料耗大， 污染嚴重， 提取精制工藝復雜， 而且產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定， 與慶大霉素 Cla結(jié)構(gòu)相似的副產(chǎn)物隨時出現(xiàn)干擾， 給依替米星產(chǎn)品質(zhì)量控制造成了極大的不 確定性， 嚴重影響了藥品的穩(wěn)定性、 安全性和有效性， 是迫切需要解決的科學難題。 若能獲得專一性慶大霉素 Cla產(chǎn)生菌， 則以上所有問題將迎刃而解， 其所帶來的經(jīng)濟效 益， 社會效益和環(huán)境效益等是極其巨大的， 更重要的是給清潔生產(chǎn)， 安全用藥， 提供了可靠 保障。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一株產(chǎn)慶大霉素 Cla的工程菌。該工程菌為滅活 功能的絳紅

8、色小單孢菌 (M rami i«/wra purpurea) GK1101菌株， 已于 2011年 9月 13日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏， 保藏編 號為 CGMCC No. 5245。所述的工程菌的發(fā)酵方法， 具體如下： 菌株 GK1101發(fā)酵前先用稀釋平板法分離出產(chǎn)孢 豐富的單菌落后， 再轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基， 37°C培養(yǎng) 10天， 挖塊接種于種子培養(yǎng)基， 37°C搖床 培養(yǎng) 28 h， 轉(zhuǎn)速為 280rpm， 然后按 10%接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基， 37°C搖床培養(yǎng) 124 h， 轉(zhuǎn) 速為 280rpm; 所述種子培養(yǎng)基：

9、葡萄糖 0.1-1.0%， 玉米淀粉 1.0-2.0%， 玉米粉 0.5-2.5%， 蛋 白胨 0.1-0.8%， 黃豆餅粉 0.5-1.5%， KN03 0.05-0.10% , CaC03 0.1-0.5% , pH6.5-7.5 , 發(fā)酵培 養(yǎng)基： 玉米淀粉 3.0-6.0%， 玉米粉 1.0-2.0%， 蛋白胨 0.1-0.8%， 黃豆餅粉 1.0-4.0 % , KN03 0.01-0.10% , (NH4)2S040.1-0.5% , CaC03 0.1-0.5% , 淀粉酶 0.001-0.025%， 6·5-7·5。所

10、述的工程菌在制備抗菌藥物中的應用。菌株 GK1101的篩選， 主要包括以下幾個步驟：A. g/基因置換質(zhì)粒的構(gòu)建；B. 置換質(zhì)粒轉(zhuǎn)化絳紅色小單孢菌；C. 轉(zhuǎn)化子的篩選；D. 工程菌組分的鑒定?；蛑脫Q的方法為 PCR擴增 上下游各 2000 bp左右的片段作為同源交換臂，并將紅 霉素抗性基因作為篩選標記插入兩交換臂之間， 將此三個片段同時連接到穿梭載體如 PKC1139上， 另外載體 pKC1139上的安普霉素抗性基因也可用于之后的篩選環(huán)節(jié)。其中轉(zhuǎn)化是以 E ET12657(pUZ8002)介導的結(jié)合轉(zhuǎn)移方法。 過程為先篩選同時含安普 霉素抗性（AmR)和紅霉素抗性（ermER)的菌株，松弛培

11、養(yǎng)后再從中篩選含紅霉素抗性（ermER) 但對安普霉素敏感 （Ams ) 的菌株。 發(fā)酵液組分檢測采用薄層層析 （TLC), 組分精確測定采 用 HPLC-MS法。本發(fā)明獲得了一株產(chǎn)生慶大霉素 Cla 的工程菌， 該工程菌為絳紅色小單孢菌 (Micromonospora purpurea) GK1101菌株， 已于 2011年 9月 13日在中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心登記保藏， 其簡稱 CGMCC, 地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路 1號院 3號， 保藏編號為 CGMCC No. 5245。 本發(fā)明的工程菌用于產(chǎn)慶大霉素 Cla， 大大簡化了生產(chǎn)工藝， 并降低生產(chǎn)成本，

12、減少環(huán)境污染， 同時提高了產(chǎn)品質(zhì)量。 達到了可大規(guī)模生產(chǎn)慶大霉素 Cla 的目標。附圖說明圖 1為慶大霉素化學結(jié)構(gòu)式。圖 2為重組質(zhì)粒 pFD306圖譜。圖 3為 基因功能同源交換滅活 （敲除） 示意圖。I： 親株染色體基因位置； II： 與染色體 KB 1側(cè)單交換； III： 與染色體 KB2側(cè)單交換； IV 染色體回復突變； V： 與:染色體雙交換。圖 4為親株絳紅色小單孢菌 S-1212與工程菌絳紅色小單孢菌 GK1101代謝產(chǎn)物的 TLC比較 分析結(jié)果； 其中 A 為工程菌絳紅色小單孢菌 GK1101 代謝產(chǎn)物； B 為親株絳紅色小單孢菌 S- 1212代謝產(chǎn)物。圖 5為親株絳紅色小單

13、孢菌 S-1212代謝產(chǎn)物的 HPLC-MS圖譜。 其中總離子流圖譜的峰 1對 應的是慶大霉素 Cla， 分子量 450.2; 峰 2， 對應的是慶大霉素 C2， 分子量 464.3 ; 峰 3， 對 應的是慶大霉素 C2b， 分子量 464.3 ; 峰 4， 對應的是慶大霉素 C2a， 分子量 464.3 ; 峰 5， 對 應的是慶大霉素 Cl， 分子量 478.3。圖 6為工程菌絳紅色小單孢菌 GK1101代謝產(chǎn)物的 HPLC-MS圖譜。 其中總離子流圖譜的峰 15對應的是慶大霉素 Cla， 分子量 450.2; 峰 20， 對應的是慶大霉素 C2b， 分子量 464.3 ; 未 檢測到慶

14、大霉素 Cl、 C2和 C2a組分的痕跡。具體實施方式實施例 1 :本發(fā)明包括以下主要步驟：1 . 構(gòu)建 基因置換質(zhì)粒根據(jù)慶大霉素生物合成基因簇 （可參考 GenBank Accession Number AY524043) , 分別在 gntK 基因（SEQ.NO.l )上下游設計兩對引物 LB1和 LB2以及 LB3和 LB4, 以出發(fā)菌株 S-1212 (周 曉蘭， 黃建忠， ，施碧紅， 施巧琴. 影響絳紅色小單孢菌 (M rami O¾wra purpure a)S-1212孢子 萌發(fā)的幾個主要因子的研究. 福建師范大學學報（自然科學版)， Vol.18 . , 72-75

15、) 的染 色體 DNA ( CTAB法）為模板， 分別進行 PCR， 擴增得到 gntK兩端的 DNA序列， 作為同源 交換臂；上游交換臂稱為 KB1 ( LB1/LB2) ,長度為 2076 bp;下游交換臂稱為 KB2(LB3/LB4)， 長度為 2044bp。 以質(zhì)粒 pAGe為模板 (朱碧銀， 洪文榮， 嚴紹德， 朱寶泉， 林玉雙， 封成軍. 黑 暗鏈霉菌 DNA同源重組系統(tǒng)的構(gòu)建. 生物技術通報 2011 ( 4)， 162 166. )， E1和 E2為引物， 擴增抗性篩選標記基因 ermE,長度為 1711bp( Fig.2)。KBl、KB2和 ermE分別經(jīng) pMD19-T(T

16、A) 克隆， 得到陽性質(zhì)粒， 依次命名為 pFD301、 pFD302和 pFD303。 pFD303經(jīng) Spe I/Xba I酶切， 回收 1711 bp片段， 與經(jīng) Xba I酶切過的pFD301 ( 4758 bp ) 進行酶連， 轉(zhuǎn)化和篩選， 得到陽 性質(zhì)粒，命名為 pFD304;用 Xba I酶切 pFD302，回收 2048bp片段，與經(jīng) Xba I酶切過的 pFD304 ( 6463 bp )進行酶連，篩選得到陽性質(zhì)粒，命名為 pFD305 ;用 Bgl II酶切 pFD305， 回收 5801 bp片段， 與經(jīng) BamH I酶切過的 pKC1139 ( 6500 bp )進行酶

17、連， 經(jīng)篩選， 最終得到陽性質(zhì)粒， 命名為 pFD306 (圖 2)。表 1 實施例所涉及的引物Restriction enzyme site are indicated by single underlines and box2. 置換質(zhì)粒 pFD306轉(zhuǎn)化絳紅色小單孢菌 S-1212將置換質(zhì)粒 pFD306 轉(zhuǎn)入 E.coli ET12567 (pUZ8002)中， 得到供體菌 E.coli ET12567 (pUZ8002, pFD306)。 然后通過接合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)化絳紅色小單孢菌 S-1212孢子， 33 °C培養(yǎng) 20 h后用含有紅霉素和萘啶酸 （終濃度均為 25 g /

18、 mL) 的水溶液覆蓋， 37 °C繼續(xù)培養(yǎng) 5 天長出轉(zhuǎn)化子，將所獲得的 ermER轉(zhuǎn)化子點接至含有紅霉素 (25-50 g / mL)、安普霉素 (25-50 g I mL)和萘啶酸（25 g / mL)的平板培養(yǎng)基上放置 37 °C進行培養(yǎng)。由于置換質(zhì)粒 pFD306 含溫敏型復制啟動子， 當培養(yǎng)溫度超過 34 °C時， 該游離質(zhì)粒在鏈霉菌中不能自我復制， 只 有質(zhì)粒 pFD306 同源交換整合到絳紅色小單孢菌染色體上的接合子才能生長， 表現(xiàn)出對紅霉 素和安普霉素抗性， 8d后孢子生長良好， 初步判斷為單交換菌株， 將長好的孢子轉(zhuǎn)接到斜面 培養(yǎng)基上。進一步提

19、取染色體 DNA進行 PCR驗證并對 PCR產(chǎn)物進行測序都證實了單交換插 入。 得到一株單交換菌株 GK1008 (pFD306)。3. 雙交換菌株篩選與發(fā)酵代謝產(chǎn)物變化的定性檢測將單交換菌株 GK1008(pFD306)在不含抗生素的斜面上連續(xù)傳 3代后，進行分離純化，挑 取單菌落分別點種到含紅霉素抗性 (紅霉素 50 g/mL)的平板和含安普霉素抗性（安普霉素 50 g/mL)的平板上， 從中篩選對安普霉素敏感而具有紅霉素抗性的菌株。挑選其中一株， 提取 其染色體 DNA作為模板， 設計 3對引物 （P1/P2, P3/P4和 P5/P6; 見表 1和圖 3 ) 進行 PCR 驗證， 并測

20、序， 確定為雙交換菌株后， 命名為絳紅色小單孢菌 GK1101。 對該菌株進行發(fā)酵 (見實施例 2步驟 1 )， 過濾收集發(fā)酵液。濾液通過硅膠 GF254薄層層析檢測， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)其主 要成分為 Cla，含少量 C2b (圖 4 A)，未見 Cl、 C2和 C2a組分（圖 4 B );濾液通過 HPLC-MS 定性檢測 （圖 6)， 與親株絳紅色小單孢菌 S-1212的代謝產(chǎn)物 （圖 5 ) 比較， 結(jié)果是主要成分 為 Cla (峰 1 )， 少量 C2b (峰 3)， 未見 C1 (峰 5)、 C2 (峰 2)和 C2a (epi-C2峰 4) 組分的 痕跡。組分的 HPLC-MS分析（圖 5

21、和圖 6): 電噴霧離子阱質(zhì)譜， C18拄； 流動相： 0.2M 三氟 乙酸水溶液： 甲醇 （95:5 ); 流速 0.6 ul/min柱溫： 30°C， 進樣量 luL。實施例 2: 絳紅色小單孢菌 GK1101代謝產(chǎn)物 Cla的制備本發(fā)明提供的 滅活工程菌絳紅色小單孢菌 GK1101可直接用于制造慶大霉素 Cla。 慶大霉素 Cla的制備如下（洪文榮. 慶大霉素發(fā)酵工藝最佳化. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志. 1994， 25(l).pl-3, ):1. 絳紅色小單孢菌 GK1101菌株的發(fā)酵培養(yǎng)種子培養(yǎng)基： 葡萄糖 0.1%， 玉米淀粉 1.0%， 玉米粉 1.5%， 蛋白胨 0.2%，

22、黃豆餅粉 1.0% KNO3 0.05 , CaC03 0.5%, 7·0。發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉 6.0%，玉米粉 1.0%，蛋白胨 0.4%，黃豆餅粉 2.0 %， 3 0.01 , (NH4)2SO40.1 , CaCO3 0.5 , 淀粉酶 0.025%， 7·5。搖瓶發(fā)酵： 將實例 1中步驟 3獲得的絳紅色小單孢菌 GK1101進行發(fā)酵。 發(fā)酵前先用稀 釋平板法分離出產(chǎn)孢豐富的單菌落再轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基， 37°C培養(yǎng) 10天， 挖塊接種于種子培 養(yǎng)基（裝量為 50mL I 250mL三角瓶）， 37°C搖床培養(yǎng) 28 h(轉(zhuǎn)速

23、為 280rpm)。 然后按 10%接種 量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基 （裝量為 50mL/250mL三角瓶）， 37°C搖床培養(yǎng) 124 h(轉(zhuǎn)速為 280rpm)。擴大發(fā)酵： 20000升發(fā)酵罐生產(chǎn)，攪拌轉(zhuǎn)速 180轉(zhuǎn) /分鐘，通氣量 1 : 0.5-1.0 (M3 /M3 -min), 培養(yǎng)基， 培養(yǎng)溫度， 接種量比例， 發(fā)酵時間等同于搖瓶發(fā)酵。2代謝產(chǎn)物提取精制 A、 粗提擴大發(fā)酵后的發(fā)酵液加 10%自來水稀釋后， 加入鹽酸， 酸化到 pH2.0-3.0， 充分攪拌 4小 時； 然后用氫氧化鈉溶液回調(diào)至 pH5.0-6.5， 投入 732NH4 +樹脂靜態(tài)

24、吸附 6-8小時。 樹脂投放 量按 5萬 u/mL左右計算。 收集吸附飽和樹脂， 用自來水漂洗干凈 （無漂浮菌絲體為止）。 飽 和樹脂裝柱，用兩倍飽和樹脂體積的 0.5M HC1溶液酸洗飽和樹脂，再用無離子水洗滌至中性， 然后改用 0.01%氨水進行堿洗， 當流出液達 pH 9.0以上時， 串聯(lián)到等體積的 711樹脂柱上， 改用 4%的氨水進行洗脫， 氨水用量為飽和樹脂體積的 8-10倍， 洗脫時間控制在 8-10小時， 收集洗脫液。B、 精制與結(jié)晶洗脫液經(jīng)薄膜濃縮到約 25-30萬 u /mL( Cla含量達 90%以上），用濃硫酸調(diào)至 pH5.5-6.0.活 性炭脫色到透光度達 92%以上

25、， 在攪拌下， 緩慢向濃縮液中滴加入 95%以上乙醇， 進行結(jié)晶， 時間 3 4小時， 之后經(jīng)固液分離， 85%乙醇溶液淋洗即得濕成品。 濕成品經(jīng)真空干燥（真空 度 500mmHg以上， 溫度 600C, 干燥 6小時）， 即得硫酸慶大霉素 Cla成品， 收率 80%以上。專利引用一株產(chǎn)慶大霉素C1a的工程菌及其應用 WO 2013060073 A1摘要提供了一種滅活gntK功能的產(chǎn)慶大霉素C1a的工程菌及其應用，其中，工程菌為絳紅色小單孢菌GK1101，已于2011年9月13日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC No.5245。該工程菌能夠用

26、于制備抗菌藥物。權利要求(1)1.1. 一株產(chǎn)慶大霉素 Cla工程菌， 其特征在于， 所述工程菌為滅活 功能的絳紅色小單孢 飄 Micwmonospom purpurea) GK1101 , 已于 2011年 9月 13日在中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心登記保藏， 保藏編號為 CGMCC No. 5245 2.2. 種如權利要求 1所述的工程菌的發(fā)酵方法， 其特征在于， 菌株 GK1101發(fā)酵前先用稀釋 平板法分離出產(chǎn)孢豐富的單菌落后， 再轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基， 37°C培養(yǎng) 10天， 挖塊接種于種子 培養(yǎng)基， 37°C搖床培養(yǎng) 28 h， 轉(zhuǎn)速為 280rpm，

27、 然后按 10%接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基， 37°C搖 床培養(yǎng) 124 h， 轉(zhuǎn)速為 280rpm; 所述種子培養(yǎng)基： 葡萄糖 0.1-1.0%， 玉米淀粉 1.0-2.0%， 玉 米粉 0.5-2.5%， 蛋白胨 0.1-0.8%， 黃豆餅粉 0.5-1.5%， KN03 0.05-0.10% , CaC03 0.1-0.5%, .5-7.5, 發(fā)酵培養(yǎng)基： 玉米淀粉 3.0-6.0% , 玉米粉 1.0-2.0% , 蛋白胨 0.1-0.8% , 黃豆餅粉 1.0-4.0 % , KN03 0.01-0.10% , (NH4)2S040.1-0.5%

28、, CaC03 0.1-0.5%, 淀粉酶 0.001-0.025%， 6·5-7·5。3.3. 如權利要求 1所述的工程菌在制備抗菌藥物中的應用。4.說明一株產(chǎn)慶大霉素 Cla的工程菌及其應用 技術領域本發(fā)明屬于抗生素制藥領域， 涉及一種工程菌的構(gòu)建及其應用， 具體地說， 本發(fā)明涉及 一株產(chǎn)慶大霉素 Cla工程菌， 應用于抗生素制造。背景技術小單孢菌可產(chǎn)生豐富的次級代謝產(chǎn)物， 特別是氨基糖苷類抗生素， 如慶大霉素、 西索米 星和福提米星等。 這些小單孢菌分布奇特， 生長緩慢且細胞壁結(jié)構(gòu)特殊， 故研究進展緩慢。 此外， 由于缺乏通用的基因操作系統(tǒng)， 小單孢菌遺傳操

29、作困難， 使得對其分子生物學的研究 也大大落后于鏈霉菌。小單孢菌是慶大霉素產(chǎn)生菌， 慶大霉素是氨基糖苷類抗生素， 已在臨床上應用了近半個 世紀， 是我國、 乃至全世界抗感染必備的基本藥物。 慶大霉素屬多組分代謝產(chǎn)物， 起抗菌作 用的主要組分為 C族復合物： Cl、 C2和 Cla。慶大霉素產(chǎn)生菌代謝產(chǎn)物可開發(fā)的組分十分豐 富， 如慶大霉素 Cla是合成抗耐藥菌藥物依替米星 （Etimicin) 的前體； 慶大霉素 B是進一 步合成抗耐藥菌藥物異帕米星的母體； 慶大霉素 、 B、 X是進一步開發(fā)抗原蟲的良好藥物； 最新研究發(fā)現(xiàn)氨基糖苷類抗生素還具有抗 HIV等功效。 因此對該類稀有藥用微生物進行

30、深入 研究， 特別是分子遺傳學方面的研究， 具有極大意義。盡管人們對小單孢菌和慶大霉素的研究已近五十年， 也取得了一些可喜的成果， 但一直 未有重大的突破。 青霉素在五十余年的研究開發(fā)過程中， 效價提高了近萬倍， 而慶大霉素僅 提高了幾十倍， 差別非常懸殊。 二十世紀八十年代興起的鏈霉菌基因工程， 已在抗生素生物 合成基因的克隆、 產(chǎn)量提高、 組分改善及雜合抗生素生產(chǎn)等方面取得了一定的進展， 但在小 單孢菌中的應用進展緩慢。依替米星是新型半合成慶大霉素， 是中國獨創(chuàng)的抗生素一類新藥， 已在多國申請專利， 其知識產(chǎn)權得到了有效保護， 需求量大， 是本類抗生素臨床首選藥物。但由于合成依替米星的母體

31、是慶大霉素 Cla (圖 1 )。 而慶大霉素 Cla需要從慶大霉素產(chǎn) 生菌的代謝產(chǎn)物中分離才能得到。 不幸的是， 到目前為止， 所有慶大霉素產(chǎn)生菌的代謝產(chǎn)物 是復合物， 主要包括慶大霉素 Cl、 C2和 Cla等。 這些復合物化學結(jié)構(gòu)相近， 理化性質(zhì)相似， 從中分離單組份慶大霉素 Cla非常困難，導致慶大霉素 Cla供不應求，且生產(chǎn)成本居高不下， 層析分離周期長， 收率低， 料耗大， 污染嚴重， 提取精制工藝復雜， 而且產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定， 與慶大霉素 Cla結(jié)構(gòu)相似的副產(chǎn)物隨時出現(xiàn)干擾， 給依替米星產(chǎn)品質(zhì)量控制造成了極大的不 確定性， 嚴重影響了藥品的穩(wěn)定性、 安全性和有效性， 是迫切需要解決

32、的科學難題。 若能獲得專一性慶大霉素 Cla產(chǎn)生菌， 則以上所有問題將迎刃而解， 其所帶來的經(jīng)濟效 益， 社會效益和環(huán)境效益等是極其巨大的， 更重要的是給清潔生產(chǎn)， 安全用藥， 提供了可靠 保障。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一株產(chǎn)慶大霉素 Cla的工程菌。該工程菌為滅活 功能的絳紅色小單孢菌 (M rami i«/wra purpurea) GK1101菌株， 已于 2011年 9月 13日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏， 保藏編 號為 CGMCC No. 5245。所述的工程菌的發(fā)酵方法， 具體如下： 菌株 GK1101發(fā)酵前先用稀釋平板法分離出產(chǎn)孢 豐富的單

33、菌落后， 再轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基， 37°C培養(yǎng) 10天， 挖塊接種于種子培養(yǎng)基， 37°C搖床 培養(yǎng) 28 h， 轉(zhuǎn)速為 280rpm， 然后按 10%接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基， 37°C搖床培養(yǎng) 124 h， 轉(zhuǎn) 速為 280rpm; 所述種子培養(yǎng)基： 葡萄糖 0.1-1.0%， 玉米淀粉 1.0-2.0%， 玉米粉 0.5-2.5%， 蛋 白胨 0.1-0.8%， 黃豆餅粉 0.5-1.5%， KN03 0.05-0.10% , CaC03 0.1-0.5% , pH6.5-7.5 , 發(fā)酵培 養(yǎng)基： 玉米淀粉 3.0-6.0%， 玉米粉 1.

34、0-2.0%， 蛋白胨 0.1-0.8%， 黃豆餅粉 1.0-4.0 % , KN03 0.01-0.10% , (NH4)2S040.1-0.5% , CaC03 0.1-0.5% , 淀粉酶 0.001-0.025%， 6·5-7·5。所述的工程菌在制備抗菌藥物中的應用。菌株 GK1101的篩選， 主要包括以下幾個步驟：A. g/基因置換質(zhì)粒的構(gòu)建；B. 置換質(zhì)粒轉(zhuǎn)化絳紅色小單孢菌；C. 轉(zhuǎn)化子的篩選；D. 工程菌組分的鑒定。基因置換的方法為 PCR擴增 上下游各 2000 bp左右的片段作為同源交換臂，并將紅 霉素抗性基因作為篩選標記插入兩交換臂之

35、間， 將此三個片段同時連接到穿梭載體如 PKC1139上， 另外載體 pKC1139上的安普霉素抗性基因也可用于之后的篩選環(huán)節(jié)。其中轉(zhuǎn)化是以 E ET12657(pUZ8002)介導的結(jié)合轉(zhuǎn)移方法。 過程為先篩選同時含安普 霉素抗性（AmR)和紅霉素抗性（ermER)的菌株，松弛培養(yǎng)后再從中篩選含紅霉素抗性（ermER) 但對安普霉素敏感 （Ams ) 的菌株。 發(fā)酵液組分檢測采用薄層層析 （TLC), 組分精確測定采 用 HPLC-MS法。本發(fā)明獲得了一株產(chǎn)生慶大霉素 Cla 的工程菌， 該工程菌為絳紅色小單孢菌 (Micromonospora purpurea) GK1101菌株

36、， 已于 2011年 9月 13日在中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心登記保藏， 其簡稱 CGMCC, 地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路 1號院 3號， 保藏編號為 CGMCC No. 5245。 本發(fā)明的工程菌用于產(chǎn)慶大霉素 Cla， 大大簡化了生產(chǎn)工藝， 并降低生產(chǎn)成本， 減少環(huán)境污染， 同時提高了產(chǎn)品質(zhì)量。 達到了可大規(guī)模生產(chǎn)慶大霉素 Cla 的目標。附圖說明圖 1為慶大霉素化學結(jié)構(gòu)式。圖 2為重組質(zhì)粒 pFD306圖譜。圖 3為 基因功能同源交換滅活 （敲除） 示意圖。I： 親株染色體基因位置； II： 與染色體 KB 1側(cè)單交換； III： 與染色體 KB2側(cè)單交換； IV 染色

37、體回復突變； V： 與:染色體雙交換。圖 4為親株絳紅色小單孢菌 S-1212與工程菌絳紅色小單孢菌 GK1101代謝產(chǎn)物的 TLC比較 分析結(jié)果； 其中 A 為工程菌絳紅色小單孢菌 GK1101 代謝產(chǎn)物； B 為親株絳紅色小單孢菌 S- 1212代謝產(chǎn)物。圖 5為親株絳紅色小單孢菌 S-1212代謝產(chǎn)物的 HPLC-MS圖譜。 其中總離子流圖譜的峰 1對 應的是慶大霉素 Cla， 分子量 450.2; 峰 2， 對應的是慶大霉素 C2， 分子量 464.3 ; 峰 3， 對 應的是慶大霉素 C2b， 分子量 464.3 ; 峰 4， 對應的是慶大霉素 C2a， 分子量 464.3 ; 峰

38、5， 對 應的是慶大霉素 Cl， 分子量 478.3。圖 6為工程菌絳紅色小單孢菌 GK1101代謝產(chǎn)物的 HPLC-MS圖譜。 其中總離子流圖譜的峰 15對應的是慶大霉素 Cla， 分子量 450.2; 峰 20， 對應的是慶大霉素 C2b， 分子量 464.3 ; 未 檢測到慶大霉素 Cl、 C2和 C2a組分的痕跡。具體實施方式實施例 1 :本發(fā)明包括以下主要步驟：1 . 構(gòu)建 基因置換質(zhì)粒根據(jù)慶大霉素生物合成基因簇 （可參考 GenBank Accession Number AY524043) , 分別在 gntK 基因（SEQ.NO.l )上下游設計兩對引物 LB1和 LB2以及 L

39、B3和 LB4, 以出發(fā)菌株 S-1212 (周 曉蘭， 黃建忠， ，施碧紅， 施巧琴. 影響絳紅色小單孢菌 (M rami O¾wra purpure a)S-1212孢子 萌發(fā)的幾個主要因子的研究. 福建師范大學學報（自然科學版)， Vol.18 . , 72-75 ) 的染 色體 DNA ( CTAB法）為模板， 分別進行 PCR， 擴增得到 gntK兩端的 DNA序列， 作為同源 交換臂；上游交換臂稱為 KB1 ( LB1/LB2) ,長度為 2076 bp;下游交換臂稱為 KB2(LB3/LB4)， 長度為 2044bp。 以質(zhì)粒 pAGe為模板 (朱碧銀， 洪文榮， 嚴紹

40、德， 朱寶泉， 林玉雙， 封成軍. 黑 暗鏈霉菌 DNA同源重組系統(tǒng)的構(gòu)建. 生物技術通報 2011 ( 4)， 162 166. )， E1和 E2為引物， 擴增抗性篩選標記基因 ermE,長度為 1711bp( Fig.2)。KBl、KB2和 ermE分別經(jīng) pMD19-T(TA) 克隆， 得到陽性質(zhì)粒， 依次命名為 pFD301、 pFD302和 pFD303。 pFD303經(jīng) Spe I/Xba I酶切， 回收 1711 bp片段， 與經(jīng) Xba I酶切過的pFD301 ( 4758 bp ) 進行酶連， 轉(zhuǎn)化和篩選， 得到陽 性質(zhì)粒，命名為 pFD304;用 Xba I酶切 pFD3

41、02，回收 2048bp片段，與經(jīng) Xba I酶切過的 pFD304 ( 6463 bp )進行酶連，篩選得到陽性質(zhì)粒，命名為 pFD305 ;用 Bgl II酶切 pFD305， 回收 5801 bp片段， 與經(jīng) BamH I酶切過的 pKC1139 ( 6500 bp )進行酶連， 經(jīng)篩選， 最終得到陽性質(zhì)粒， 命名為 pFD306 (圖 2)。表 1 實施例所涉及的引物Restriction enzyme site are indicated by single underlines and box2. 置換質(zhì)粒 pFD306轉(zhuǎn)化絳紅色小單孢菌 S-1212將置換質(zhì)粒 pFD306 轉(zhuǎn)入

42、 E.coli ET12567 (pUZ8002)中， 得到供體菌 E.coli ET12567 (pUZ8002, pFD306)。 然后通過接合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)化絳紅色小單孢菌 S-1212孢子， 33 °C培養(yǎng) 20 h后用含有紅霉素和萘啶酸 （終濃度均為 25 g / mL) 的水溶液覆蓋， 37 °C繼續(xù)培養(yǎng) 5 天長出轉(zhuǎn)化子，將所獲得的 ermER轉(zhuǎn)化子點接至含有紅霉素 (25-50 g / mL)、安普霉素 (25-50 g I mL)和萘啶酸（25 g / mL)的平板培養(yǎng)基上放置 37 °C進行培養(yǎng)。由于置換質(zhì)粒 pFD306 含溫敏型復制啟動子，

43、當培養(yǎng)溫度超過 34 °C時， 該游離質(zhì)粒在鏈霉菌中不能自我復制， 只 有質(zhì)粒 pFD306 同源交換整合到絳紅色小單孢菌染色體上的接合子才能生長， 表現(xiàn)出對紅霉 素和安普霉素抗性， 8d后孢子生長良好， 初步判斷為單交換菌株， 將長好的孢子轉(zhuǎn)接到斜面 培養(yǎng)基上。進一步提取染色體 DNA進行 PCR驗證并對 PCR產(chǎn)物進行測序都證實了單交換插 入。 得到一株單交換菌株 GK1008 (pFD306)。3. 雙交換菌株篩選與發(fā)酵代謝產(chǎn)物變化的定性檢測將單交換菌株 GK1008(pFD306)在不含抗生素的斜面上連續(xù)傳 3代后，進行分離純化，挑 取單菌落分別點種到含紅霉素抗性 (紅霉素

44、50 g/mL)的平板和含安普霉素抗性（安普霉素 50 g/mL)的平板上， 從中篩選對安普霉素敏感而具有紅霉素抗性的菌株。挑選其中一株， 提取 其染色體 DNA作為模板， 設計 3對引物 （P1/P2, P3/P4和 P5/P6; 見表 1和圖 3 ) 進行 PCR 驗證， 并測序， 確定為雙交換菌株后， 命名為絳紅色小單孢菌 GK1101。 對該菌株進行發(fā)酵 (見實施例 2步驟 1 )， 過濾收集發(fā)酵液。濾液通過硅膠 GF254薄層層析檢測， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)其主 要成分為 Cla，含少量 C2b (圖 4 A)，未見 Cl、 C2和 C2a組分（圖 4 B );濾液通過 HPLC-MS 定性檢測

45、 （圖 6)， 與親株絳紅色小單孢菌 S-1212的代謝產(chǎn)物 （圖 5 ) 比較， 結(jié)果是主要成分 為 Cla (峰 1 )， 少量 C2b (峰 3)， 未見 C1 (峰 5)、 C2 (峰 2)和 C2a (epi-C2峰 4) 組分的 痕跡。組分的 HPLC-MS分析（圖 5和圖 6): 電噴霧離子阱質(zhì)譜， C18拄； 流動相： 0.2M 三氟 乙酸水溶液： 甲醇 （95:5 ); 流速 0.6 ul/min柱溫： 30°C， 進樣量 luL。實施例 2: 絳紅色小單孢菌 GK1101代謝產(chǎn)物 Cla的制備本發(fā)明提供的 滅活工程菌絳紅色小單孢菌 GK1101可直接用于制造慶大霉

46、素 Cla。 慶大霉素 Cla的制備如下（洪文榮. 慶大霉素發(fā)酵工藝最佳化. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志. 1994， 25(l).pl-3, ):1. 絳紅色小單孢菌 GK1101菌株的發(fā)酵培養(yǎng)種子培養(yǎng)基： 葡萄糖 0.1%， 玉米淀粉 1.0%， 玉米粉 1.5%， 蛋白胨 0.2%， 黃豆餅粉 1.0% KNO3 0.05 , CaC03 0.5%, 7·0。發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉 6.0%，玉米粉 1.0%，蛋白胨 0.4%，黃豆餅粉 2.0 %， 3 0.01 , (NH4)2SO40.1 , CaCO3 0.5 , 淀粉酶 0.025%， 7·5。搖瓶發(fā)酵： 將實例 1中步驟 3獲得的絳紅色小單孢菌 GK1101進行發(fā)酵。 發(fā)酵前先用稀 釋平板法分離出產(chǎn)孢豐富的單菌落再轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基， 37°C培養(yǎng) 10天， 挖塊接種于種子培 養(yǎng)基（裝量為 50mL I 250mL三角瓶）， 37°C搖床培養(yǎng) 28 h(轉(zhuǎn)速為 280rpm)。 然后按 10%接種 量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基 （裝量為 50mL/250mL三角瓶）， 37°C搖床培養(yǎng) 124 h(轉(zhuǎn)速為 280rpm)。擴大發(fā)酵： 200