C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞遷移的初步研究

1、C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞遷移的初步研究 作者：高樹梓，高宜錄，林社裕，劉道坤【摘要】 目的：觀察體外培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞在體外能否引起神經(jīng)干細(xì)胞的遷移，從而為研究膠質(zhì)瘤細(xì)胞中存在促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞遷移的物質(zhì)打下基礎(chǔ)。方法：分別培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞。以星形膠質(zhì)細(xì)胞為對照，做細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，觀察其結(jié)果；將C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞的無血清培養(yǎng)上清分別濃縮，并行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，觀察其結(jié)果。結(jié)果：（1）C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清引起神經(jīng)干細(xì)胞遷移的數(shù)目明顯多于星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)上清和新鮮無血清培養(yǎng)基（P0.01）；（2）將無血清培養(yǎng)的等濃度的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞、星形膠

2、質(zhì)細(xì)胞的上清濃縮蛋白電泳，可見二者蛋白條帶存在明顯差異。結(jié)論：（1）從新生大鼠大腦皮層組織可以培養(yǎng)出神經(jīng)干細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。（2）C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)的上清中存在著能夠誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞遷移的物質(zhì)。 【關(guān)鍵詞】 膠質(zhì)瘤細(xì)胞；神經(jīng)干細(xì)胞；星形膠質(zhì)細(xì)胞；細(xì)胞遷移已有研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞而且在體內(nèi)可以誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向膠質(zhì)瘤方向遷移1，2。盡管未成熟神經(jīng)元遷移的機(jī)制十分復(fù)雜，但其遷移的方向和路徑的識別與局部的某種信號物質(zhì)有關(guān)。膠質(zhì)瘤細(xì)胞中是否存在這種信號物質(zhì)尚未見報(bào)道。我們采用體外培養(yǎng)技術(shù)，觀察C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清在體外有無誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞遷移的作用。為進(jìn)一步通過生化技術(shù)將膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的該信號物質(zhì)進(jìn)

3、行分離和純化打下基礎(chǔ)。為將該信號物質(zhì)與神經(jīng)干細(xì)胞一起應(yīng)用于臨床，提高腦及脊髓損傷、膠質(zhì)瘤和中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的治療效果奠定基礎(chǔ)。1 材料和方法1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞：新生SD大鼠（由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）；C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株（中科院上海細(xì)胞所）。（2）試劑及抗體：DMEM/F12，B27 Serum-Free Supplement（Invitrogen公司）；堿性成纖維生長因子 (Peprotech公司)；5-溴-2脫氧尿苷(Neomarkers公司)；小鼠抗-Nestin IgG1（Chemicon公司）；小鼠抗5-溴-2脫氧尿苷IgG1（Neomarkers公司）；小鼠抗

4、膠原纖維酸性蛋白IgG1和異硅氰酸熒光素抗小鼠IgG（Sigma公司）。1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定方法 （1）神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定：從新生SD大鼠大腦皮層分離培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞。用無血清培養(yǎng)基DMEMF12培養(yǎng)約7d，使得神經(jīng)干細(xì)胞處于指數(shù)生長期。貼壁、固定、洗滌后用含10%羊血清、0.3% Triton-100的0.01mol/L PBS液在37條件下封閉孵育10min。加一抗（小鼠抗Nestin IgG，1500倍稀釋），4過夜，洗滌加入二抗（FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，按1150稀釋），避光37孵育30min。共聚焦顯微鏡下觀察。細(xì)胞傳代能力鑒定5-溴-2脫氧尿苷免疫熒光檢測：將獲得的原代神

5、經(jīng)球吹打制成單細(xì)胞懸液，接種至含5-溴-2脫氧尿苷濃度為5mol/L的培養(yǎng)液中培養(yǎng)57d即可形成次代神經(jīng)球。貼壁、固定、封閉，免疫熒光染色和觀察均同前。小鼠抗5-溴-2脫氧尿苷IgG1按11000倍稀釋，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，按1200倍稀釋；（2）星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定：從SD新生紅皮鼠大腦皮層分離星形膠質(zhì)細(xì)胞，用含20%小牛血清培養(yǎng)基DMEM/F12培養(yǎng)約28天，使得星形膠質(zhì)細(xì)胞處于指數(shù)生長期。免疫熒光法檢測培養(yǎng)細(xì)胞的膠質(zhì)原纖維酸性蛋白表達(dá)方法同前。小鼠抗膠質(zhì)原纖維酸性蛋白IgG1，按1500倍稀釋,FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，按1200倍稀釋；（3）C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)：用含2

6、0%小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)46d，待細(xì)胞生長處于對數(shù)期時(shí)使用；（4）細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：用多聚碳酸膜有8m微孔的“Transwell” 細(xì)胞培養(yǎng)室進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)前36h，把培養(yǎng)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的含小牛血清的上清去掉，用0.01mol/L PBS沖洗3遍，然后換上無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)36h。遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)共分3組，基本培養(yǎng)基為第1組：在細(xì)胞培養(yǎng)室的下室加入無血清培養(yǎng)基600l；C6細(xì)胞培養(yǎng)上清為第2組：在細(xì)胞培養(yǎng)室的下室加入C6細(xì)胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的上清400l和200l無血清培養(yǎng)基；星形細(xì)胞培養(yǎng)上清為第3組：在細(xì)胞培養(yǎng)室的下室加入星形膠質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)

7、基培養(yǎng)的上清400l和200l無血清培養(yǎng)基。在上述3組的細(xì)胞培養(yǎng)室的上室加入神經(jīng)干細(xì)胞懸液（6.7×102個(gè)/ml)200l,共培養(yǎng)36h。取出培養(yǎng)杯，甲醇固定10min，PBS洗3次； Giemsa染色10min，PBS洗3次；用解剖刀取下膜，轉(zhuǎn)置在自制的帶網(wǎng)格的載玻片上，取中間9個(gè)格進(jìn)行光鏡下放大100倍計(jì)數(shù)。1.3 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 （1）星形膠質(zhì)細(xì)胞與C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞上清蛋白的濃縮：將無血清培養(yǎng)36h的星形膠質(zhì)細(xì)胞上清和C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞上清分別用吸管轉(zhuǎn)移至離心管中12000rpm/min離心約12min，取上清按20l/ml的比例加入蛋白酶抑制劑組合后，轉(zhuǎn)移到截留分子量為

8、3kD的centricon型微型濃縮器中，7500rpm/min離心120min。樣品管中則留下微量濃縮的上清蛋白，翻轉(zhuǎn)樣品管和儲(chǔ)液帽，100rpm/min離心2min后，于儲(chǔ)液帽中得到星形膠質(zhì)細(xì)胞上清濃縮蛋白，其濃度較濃縮前能提高約40倍；（2）蛋白定量實(shí)驗(yàn)：取適量考馬斯亮藍(lán)CBBG250貯備液用雙蒸水14稀釋配成應(yīng)用液。取適量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（62.8g/L）用生理鹽水稀釋成1.3mg/ml以下的濃度備用。取等體積的濃縮的C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞上清蛋白和星形膠質(zhì)細(xì)胞上清蛋白分別用生理鹽水按19稀釋成10%的溶液待測。取4個(gè)eppendorf管，按表1進(jìn)行分組，充分混勻后靜置10min。于96孔培養(yǎng)板中

9、選并排的4個(gè)孔，分別加入上述4管溶液各200l，每個(gè)樣品測2次作一重復(fù)。利用BIO-TEKELX800酶標(biāo)儀在570nm處進(jìn)行檢測。根據(jù)檢測結(jié)果，在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的濃縮上清中加適量PBS使其最終蛋白濃度與星形膠質(zhì)細(xì)胞相等；（3）蛋白電泳：在等濃度的C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞上清和星形膠質(zhì)細(xì)胞上清的濃縮蛋白樣品液中分別加入等量上樣緩沖液。經(jīng)12%聚丙烯酸胺凝脂電泳后，一塊經(jīng)CBB染色，另一塊轉(zhuǎn)移至PVDF膜，染色，剪下差異蛋白條帶測序。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Stata7.0軟件，組間比較采用方差分析，兩組間比較采用最小顯著差數(shù)法。2 結(jié)果2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)和GFAP免疫熒光檢測 分離的大鼠

10、大腦皮層細(xì)胞在原代培養(yǎng)（種植）4h后，部分細(xì)胞即可長出細(xì)小胞突，培養(yǎng)34d后，細(xì)胞數(shù)量便明顯增加,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，培養(yǎng)物中星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例越來越大，而神經(jīng)元及其它細(xì)胞成分的比例越來越小。大鼠大腦皮層細(xì)胞原代培養(yǎng)一般在914d，以星形膠質(zhì)細(xì)胞為主的細(xì)胞即可長滿培養(yǎng)瓶壁，可見到少突膠質(zhì)細(xì)胞生長在星形膠質(zhì)細(xì)胞層上。經(jīng)傳代后星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例更高,幾近單一細(xì)胞培養(yǎng)物。鏡下體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體較大、很扁，形狀不規(guī)則，胞質(zhì)較豐富，細(xì)胞核圓形或卵圓形，長偏于胞體的一側(cè)，內(nèi)有12個(gè)核仁。胞突尤其是初級胞突較多較長。我們對培養(yǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行GFAP免疫熒光檢測顯示,絕大多數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)為GFAP陽性，說

11、明培養(yǎng)的細(xì)胞是星形膠質(zhì)細(xì)胞(圖1)。2.2 神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定 新生大鼠大腦皮層細(xì)胞在接種后大部分存活，胞體光滑圓潤,胞質(zhì)透亮，2448h內(nèi)細(xì)胞開始聚集，形成細(xì)胞團(tuán)，隨后聚集的細(xì)胞迅速分裂，細(xì)胞團(tuán)中的細(xì)胞數(shù)量快速增加，至34d已初步形成神經(jīng)球，培養(yǎng)至1w左右時(shí)每個(gè)培養(yǎng)瓶中可形成數(shù)十個(gè)至百余個(gè)呈懸浮生長、大小基本一致、形態(tài)規(guī)則的神經(jīng)球，絕大多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞球周圍無突起生長，有少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞球之間有少量突起相連，有極少量神經(jīng)細(xì)胞球沉至瓶底及少量神經(jīng)干細(xì)胞長出突起而分化。另外可觀察到在接種密度較高或較低時(shí)，神經(jīng)干細(xì)胞均生長不良，形成的神經(jīng)球數(shù)目減少。我們所培養(yǎng)的神經(jīng)球內(nèi)的幾乎所有細(xì)胞均呈nestin陽性

12、，nestin為神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志物從而證明該細(xì)胞球是神經(jīng)干細(xì)胞球（圖2）。我們將神經(jīng)干細(xì)胞球用含5-BrdU的培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液并培養(yǎng)，7d左右可形成次代神經(jīng)細(xì)胞球。對次代神經(jīng)細(xì)胞球進(jìn)行抗-BrdU免疫熒光檢測顯示：次代神經(jīng)細(xì)胞球中，絕大多數(shù)細(xì)胞呈BrdU陽性，BrdU為細(xì)胞增殖的標(biāo)志，說明次代神經(jīng)細(xì)胞球中大部分細(xì)胞具有分裂增殖能力（圖3）。2.3 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果 每次實(shí)驗(yàn)每組做3個(gè)孔，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。每孔的遷移細(xì)胞球數(shù)為光鏡下放大100倍，中間9個(gè)格中的平均數(shù)，結(jié)果見表2。方差分析結(jié)果顯示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=34.8519，P0.01）。各組間進(jìn)行多重比較，采用最小顯著差數(shù)法：LS

13、D0.05=5.7437 LSD0.01=7.7837，見表3。從統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的上清引起神經(jīng)干細(xì)胞遷移的數(shù)目與星形膠質(zhì)細(xì)胞的上清，新鮮無血清培養(yǎng)基在極顯著水平上有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，星形膠質(zhì)細(xì)胞與新鮮無血清培養(yǎng)基也在極顯著水平上有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4、5），說明C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的上清明顯地促進(jìn)了神經(jīng)干細(xì)胞的遷移。2.4 SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果 電泳結(jié)果顯示C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的濃縮上清與星形膠質(zhì)細(xì)胞的濃縮上清間存在差異蛋白，即在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的上清蛋白條帶中存在特異蛋白條帶（圖6）。3 討論3.1 神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng) 神經(jīng)干細(xì)胞的研究一直是神經(jīng)科學(xué)界的一個(gè)熱點(diǎn)，如何快速經(jīng)濟(jì)地培養(yǎng)出神經(jīng)干細(xì)胞具

14、有重要的現(xiàn)實(shí)意義。從實(shí)驗(yàn)用神經(jīng)干細(xì)胞獲取的角度看，從胎腦的紋狀體區(qū)和海馬齒狀回容易獲得，但對動(dòng)物和取材技術(shù)要求較高。用成熟大鼠取材對培養(yǎng)技術(shù)和培養(yǎng)基要求也較高，不易存活。目前多數(shù)研究者采用胎鼠組織作為神經(jīng)干細(xì)胞的組織來源，我們采用新生35d的大鼠作為神經(jīng)干細(xì)胞的組織來源，應(yīng)用DMEM/F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上添加不同成分，培養(yǎng)出了具有分裂增殖能力的神經(jīng)干細(xì)胞。此法具有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物容易獲得、取材簡單、省時(shí)經(jīng)濟(jì)、一次可獲得大量神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞易成活的優(yōu)點(diǎn)。3.2 C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對神經(jīng)干細(xì)胞的遷移作用 大量研究表明，神經(jīng)干細(xì)胞具有遷移追蹤腫瘤細(xì)胞的能力1，膠質(zhì)瘤對神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)遷移

15、作用在體內(nèi)也已被證實(shí)1，2。這說明膠質(zhì)瘤的生長環(huán)境中或膠質(zhì)瘤細(xì)胞本身存在某些因子誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生了遷移。既然膠質(zhì)瘤細(xì)胞能產(chǎn)生這種信號物質(zhì)，那么在體外培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞是否也具有該物質(zhì)，對此尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。我們在體外培養(yǎng)條件下，通過transwell細(xì)胞培養(yǎng)室進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，觀察膠質(zhì)瘤細(xì)胞對神經(jīng)干細(xì)胞的遷移作用，研究結(jié)果顯示，與星形膠質(zhì)細(xì)胞上清相比，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的上清明顯地促進(jìn)了神經(jīng)干細(xì)胞的遷移，且在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的上清蛋白條帶中存在特異蛋白條帶，說明在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清中也存在促使神經(jīng)干細(xì)胞遷移的物質(zhì)。已有研究表明神經(jīng)干細(xì)胞的遷移機(jī)制有早期的輻射狀遷移和中晚期的鏈狀遷移3，4?？赡芘c

16、細(xì)胞的成熟程度、細(xì)胞的周圍環(huán)境以及細(xì)胞所在的基質(zhì)的狀態(tài)、細(xì)胞間的通訊、干細(xì)胞自身及臨近或遠(yuǎn)隔部位其他細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子、黏附分子、激素、遞質(zhì)細(xì)胞代謝產(chǎn)物等有關(guān)。另外，實(shí)驗(yàn)選用星形膠質(zhì)細(xì)胞作為對照，是因?yàn)樵诟箓?cè)梨狀皮質(zhì)區(qū)和嗅球表達(dá)的干細(xì)胞進(jìn)行遠(yuǎn)距離遷移與膠質(zhì)細(xì)胞無關(guān)5，況且星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦內(nèi)分布十分廣泛，而移植入腦內(nèi)的神經(jīng)干細(xì)胞總向一些特定區(qū)域遷移，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明神經(jīng)干細(xì)胞的遷移與星形膠質(zhì)細(xì)胞無關(guān)。本研究蛋白電泳顯示，膠質(zhì)瘤細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞之間，不僅有蛋白量的差異，也有著質(zhì)的不同。盡管我們目前還未能證實(shí)這些差異蛋白哪些能誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞的遷移，但這已為尋找膠質(zhì)瘤中引起神經(jīng)干細(xì)胞遷移的物質(zhì)打下了

17、基礎(chǔ)，為神經(jīng)干細(xì)胞應(yīng)用于臨床，提高腦及脊髓損傷、膠質(zhì)瘤和中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的治療效果提供理論依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Aboody KS, Brown A, Rainove NG， et al. Neural stem cells display textensive tropism for pathology in adult brain: evidence from intracranial gliomasJ. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 97（23）:12846-12851.2 Tang Y, Shah K, Messerli SM, et al. In vivo tracking of neural progenytor cell migration to glioblastomasJ.Hum Gene Ther, 2003, 13:1247-1254.3 Corbin JG, Nery S, Fishell G. Telencephalic cells take a tangent: non-radial migration in the mammalian forebrainJ. Nat Neurosci, 2