TGFβ和BDNF聯(lián)合誘導(dǎo)成年大鼠BMSC向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的研究

1、TGF-和BDNF聯(lián)合誘導(dǎo)成年大鼠BMSC向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的研究 作者：梅晰凡，呂剛，王巖松，李全雙，郭占鵬【摘要】 目的 探討轉(zhuǎn)化因子(TGF-)和腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)聯(lián)合誘導(dǎo)成年大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞成神經(jīng)細(xì)胞的可能性，為神經(jīng)再生及脊髓損傷的治療提供一種新方法。方法 從大鼠骨髓中分離培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞并傳至第5代，誘導(dǎo)前2 h先用含1 g/L轉(zhuǎn)化因子（TGF-）及20%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，以促進(jìn)細(xì)胞分裂，然后用腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)作誘導(dǎo)劑，觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，并采用免疫組織化學(xué)法檢測誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)NF，NSE，GFAP等特異性標(biāo)志物。結(jié)果 誘導(dǎo)后5 h，部分細(xì)胞的形態(tài)

2、已發(fā)生改變，12 h后大部分細(xì)胞不僅在形態(tài)上表現(xiàn)為神經(jīng)元樣特征，而目NF及NSE等特異性抗體呈陽性表達(dá)，而GFAP抗體表達(dá)呈陰性。結(jié)論 轉(zhuǎn)化因子(TGF-)和腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)能將骨髓基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)成神經(jīng)元樣細(xì)胞。 【關(guān)鍵詞】 骨髓基質(zhì)細(xì)胞；轉(zhuǎn)化因子；腦源性神經(jīng)生長因子；細(xì)胞分化；神經(jīng)元樣細(xì)胞 Abstract：Objective To study the possibility that transforming growth factor- and brain-derived neurotrophic factor induces adult rat bone marrow st

3、romal cells(BMSCs) into neurons, and provide a new method for neuron regeneration and the treatment of spine cord injury. Methods The bone marrow stromal cells from adult rats were isolated and cultured for 5 passages. The BMSCs were incubated with DMEM containing 20% FRS and TGF-(1g/L )for 2 hours.

4、 Then the media were replaced by DMEM media consisting of BDNF(50g/mL). The morphological changes of the cells were observed under phase contrast microscope，the cells were stained immunocytochemically with NF，NSE and GFAP antibodies respectively. Results After 5 hour of induction with neurotrophic f

5、actor, some cells showed morphological changes, and 12 hours later,many BMSCs became neuron-like cells and were stained positively with NF，NSE antibody，but negatively with GFAP.Conclusions The bone marrow stromal cells can differentiate into neuronlike cells by the induction of transforming growth f

6、actor-and brain-derived neurotrophic factor. Key words：bone marrow stromal cells；transforming growth factor-；brain-derived neurotrophic factor；cell differentiation induction；neuron-like cells 近年來的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后采用組織工程方法，將有活性的種子細(xì)胞移植治療脊髓損傷，能促使損傷軸突修復(fù)、再生和恢復(fù)脊髓部分神經(jīng)功能，骨髓基質(zhì)細(xì)胞（MSC）可為基因治療神經(jīng)系統(tǒng)的疾病提供良好的載體1。骨髓基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分

7、化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞的研究也見報道，為了探討轉(zhuǎn)化因子和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對骨髓基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞聯(lián)合誘導(dǎo)分化的可能性和條件，為以后神經(jīng)細(xì)胞再生和脊髓內(nèi)移植的研究奠定基礎(chǔ)23，本研究觀察了轉(zhuǎn)化因子（transforming growth factor-，TGF-）和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子( brain-derived neurotrophic factor, BDNF)對成年大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用，現(xiàn)報告如下。 1 材料與方法 1.1 主要試劑和儀器 TGF-和BDNF購自Sigma公司，小鼠抗特異性神經(jīng)元烯醇化酶( NSE)單抗，小鼠抗神經(jīng)絲蛋白(NF)單抗，小鼠抗膠質(zhì)纖維酸性

8、蛋白(GFAP)單抗購自華美公司, FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG購自 Gibco公司，SABC試劑盒購自武漢博士德公司。主要儀器：Olympus CK40倒置顯微鏡，Olympus BX51熒光顯微鏡。SD大鼠由錦州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。 1.2 骨髓基質(zhì)細(xì)胞的分離及培養(yǎng) 梅晰凡，等：TGF-和BDNF聯(lián)合誘導(dǎo)成年大鼠BMSC向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的研究遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報 2008年10月，29(5)SD大鼠雌雄不限，130 g左右，將其拉頸處死，75%酒精浸泡10 min，無菌條件下取出股骨，除去骨周圍的肌肉組織，剪開骨兩端，顯露骨髓腔，用10 mL注射器，以IMDM培養(yǎng)液從一端沖洗骨髓腔，將骨髓沖到

9、平皿中，用吸管反復(fù)吹打含有骨髓的沖洗液使其成為單細(xì)胞懸液，后用150目尼龍網(wǎng)過濾，濾液常溫下1000 rpm離心10 min，棄上清，沉淀內(nèi)加入紅細(xì)胞裂解液(每只鼠骨髓內(nèi)加入1 mL)置常溫下2 min，后加入IMDM培養(yǎng)液10 mL，吹散后1000 rpm離心10 min，棄上清后向沉淀內(nèi)加入IMDM含10%FBS培養(yǎng)液10 mL，吹散后計數(shù)，將細(xì)胞稀釋后按8 000個細(xì)胞cm2接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，于37 5CO2及飽和濕度下培養(yǎng)，相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況，分別于培養(yǎng)的第4、10、17天半量更換培養(yǎng)液，去除未貼壁細(xì)胞4，第20 天以0.25胰蛋白酶消化傳代得到骨髓基質(zhì)細(xì)胞接種于培養(yǎng)

10、皿中，培養(yǎng)皿內(nèi)置經(jīng)多聚賴氨酸（Poly-L-Lysine）防脫片處理的蓋玻片。 1.3 轉(zhuǎn)化因子和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子聯(lián)合誘導(dǎo)鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞 上述細(xì)胞傳代至第5代后繼續(xù)培養(yǎng)，加入含1 g/L轉(zhuǎn)化因子（TGF-）預(yù)誘導(dǎo)2 h，然后用含50 g/mL腦源性神經(jīng)生長因子（BDNF）的IMDM念20%FBS培養(yǎng)基地37 5%CO2及包和濕度下培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞對其進(jìn)行分化誘導(dǎo)；以單純IMDM含20%FBS培養(yǎng)基同等條件培養(yǎng)作對照1；并以含1 g/L TGF-的IMDM含20%FBS培養(yǎng)基同等條件培養(yǎng)作對照2；并以含50 g/mL BDNF的IMDM含20%FBS培養(yǎng)基同等條件培養(yǎng)作對照3。相差顯微鏡下觀察

11、細(xì)胞形態(tài)變化，培養(yǎng)3天后，吸棄培養(yǎng)液，0.01 M PBS沖洗3次，4 丙酮固定-70 保存?zhèn)涿庖呒?xì)胞化學(xué)染色。 1.4 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的鑒定和轉(zhuǎn)化率的測定 吸棄培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液；純丙酮室溫固定2030 min，蒸餾水洗，干燥后可冰凍保存；冰凍切片從冰箱內(nèi)取出，恢復(fù)至室溫，PBS沖洗3 次；純甲醇加H2O2至0.5%，室溫浸泡30 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水洗3 次；滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，不洗；滴加適當(dāng)稀釋的一抗（小鼠IgG），其中小鼠抗大鼠NSE(-)抗體稀釋度為1100，小鼠抗大鼠NF抗體稀釋度為1200，對照實(shí)驗(yàn)以0.01 M PBS液代替抗體，3

12、7 3060 min或20 60120 min，也可4 過夜；0.01 M PBS洗2 min3次。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，2037 20 min。0.01 M PBS洗2 min3次。滴加試劑SABC，203720 min。0.01 M PBS洗5 min4次，DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒（ED1022），取1 mL蒸餾水，加試劑盒中A，B，C試劑各1滴，混勻后加至切片，室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時間，一般在530 min之間，蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復(fù)染，逐級脫水，透明，封片。光鏡下觀察，隨機(jī)選取5個視野，每個視野計數(shù)200個細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞數(shù)目。 2 結(jié) 果 2.1 大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)

13、胞生長情況 剛接種時細(xì)胞種類較多，包括造血干細(xì)胞及分化程度不同的其它各系血細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞等，散在懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)。培養(yǎng)12天后，骨髓基質(zhì)細(xì)胞開始貼壁，經(jīng)過數(shù)次換液后，未貼壁的細(xì)胞逐步被清除，培養(yǎng)10 天時，細(xì)胞以造血干細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞等貼壁生長的細(xì)胞為主5；培養(yǎng)20 天后，大多數(shù)造血干細(xì)胞死亡，剩下的主要是骨髓基質(zhì)細(xì)胞。典型的骨髓基質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)是：型細(xì)胞較少，梭形，70 m8 m大小，胞核20 m5 m大小；型細(xì)胞為主要類型，形態(tài)差異較大，胞體大而扁平，3050 m大小，有突起，胞核圓形，直徑1520 m，立體感不強(qiáng)，胞漿淡染。同時，混有少量造血干細(xì)胞。 2.2 誘導(dǎo)后的形態(tài)變化 骨髓

14、基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)過轉(zhuǎn)化因子（TGF-）預(yù)誘導(dǎo)2 h后，細(xì)胞形態(tài)變化不大，但細(xì)胞的胞體變大，BDNF誘導(dǎo)5 h后，部分細(xì)胞分化，胞體向胞核收縮呈錐形，有折光性，有較多的長突起，交織成網(wǎng)狀，類似神經(jīng)元樣細(xì)胞。此時細(xì)胞無明顯增殖現(xiàn)象。而未加人BDNF的對照組細(xì)胞形態(tài)基本保持原來的形態(tài)不變6-7。12 h后大部分細(xì)胞不僅在形態(tài)上表現(xiàn)為神經(jīng)元樣特征，細(xì)胞突起之間似發(fā)生聯(lián)系，變化呈漸進(jìn)性（圖1-6）。 2.3 大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化后的鑒定和轉(zhuǎn)化率的測定 神經(jīng)樣細(xì)胞的胞體和突起NSE(-)和NF染色呈強(qiáng)陽性，而未分化的骨髓基質(zhì)細(xì)胞為陰性。定量計數(shù)分析實(shí)驗(yàn)組表達(dá)NSE(-)約為(69.63.8)%，表達(dá)NF約為(7

15、0.63.3)%。對照1組基本不表達(dá)NSE(-)和NF，對照2組少量表達(dá)NSE(-)和NF（<5%），對照3表達(dá)NSE(-) 約為(42.62.9)%，NF約為(43.63.1)%，（見表1）。表1 實(shí)驗(yàn)組與對照組比較NSENF實(shí)驗(yàn)組*P0.05與對照組1比較3 討 論 3.1 骨髓基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化對脊髓損傷治療的意義 中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)損傷后，由于內(nèi)在的再生能力差和外在的微環(huán)境的抑制，軸突再生一直是脊髓損傷修復(fù)的“瓶頸”。隨著近年來干細(xì)胞研究逐漸成為生命科學(xué)領(lǐng)域中繼基因工程后新的全球生物高新技術(shù)焦點(diǎn)和熱點(diǎn)，作為干細(xì)胞之一的BMSCs。因其潛力的逐漸開發(fā)而顯其獨(dú)特優(yōu)勢，在脊髓損傷中表現(xiàn)突出

16、：它能促使損傷軸突修復(fù)、再生和恢復(fù)脊髓部分神經(jīng)功能，MSC能從患者自體不斷獲得，誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細(xì)胞后自體移植免疫排斥反應(yīng)弱，同時又避免了倫理問題困擾，克服了從腦組織中獲得神經(jīng)干細(xì)胞的采集困難、易造成神經(jīng)功能缺失等缺陷，使其適用于臨床個體化治療。骨髓基質(zhì)細(xì)胞除了提供細(xì)胞外基質(zhì)，支持和調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的自我更新和分化外，本身還具有很強(qiáng)的增殖力和多向分化的潛能。MSC誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞，移植后治療脊髓損傷是目前最新的、具有創(chuàng)意的研究趨勢。Chopp等8在成功建立大鼠脊髓挫傷模型1周后，將標(biāo)記的BMSCs移植到大鼠的損傷脊髓處，通過免疫組化和對神經(jīng)系統(tǒng)功能評分，觀察到脊髓功能有顯著恢復(fù)。田毅浩等9通過

17、BMSCs與NSCs混合培養(yǎng)，以NSCs的自然分化狀態(tài)模擬神經(jīng)發(fā)育的早期微環(huán)境，成功誘導(dǎo)了BMSCs 轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元這說明BMSCs源性神經(jīng)元在轉(zhuǎn)分化中有由不成熟到成熟的過程。本實(shí)驗(yàn)大鼠BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化成功，在此基礎(chǔ)上可以設(shè)想利用患者自身的BMSCs體外培養(yǎng)擴(kuò)增，用于脊髓損傷的治療，恢復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能，由于BMSCs取自自體，由它誘導(dǎo)而來的神經(jīng)細(xì)胞在進(jìn)行移植時不存在組織配型及免疫排斥問題，也無胚胎干細(xì)胞的倫理道德問題。 3.2 轉(zhuǎn)化因子和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對骨髓基質(zhì)細(xì)胞的誘導(dǎo)作用 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞在轉(zhuǎn)化因子和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)下可出現(xiàn)分化，分化細(xì)胞胞體呈錐形，突起交

18、織成網(wǎng)狀，類似神經(jīng)細(xì)胞，細(xì)胞突起之間似發(fā)生聯(lián)系，并且表達(dá)神經(jīng)元特異性標(biāo)志NSE(-)和NF，提示骨髓基質(zhì)細(xì)胞在轉(zhuǎn)化因子和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子聯(lián)合誘導(dǎo)下有可能分化成為神經(jīng)元。TGF-的作用是促進(jìn)間質(zhì)來源的骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的分泌。TGF-與骨髓基質(zhì)細(xì)胞的TGF-RI和TGF-R受體結(jié)合，使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)絲/蘇氨酸磷酸化，促進(jìn)鈣離子內(nèi)流和磷酸肌醇釋放，與BDNF有相加作用，增加細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和誘導(dǎo)后的細(xì)胞成熟，但其確切機(jī)制尚不清楚。BDNF屬神經(jīng)生長因子，是一類對神經(jīng)元的分化和突起的生長、存活和功能起支持和促進(jìn)作用的蛋白質(zhì)10。BDNF能維持神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活，具有神經(jīng)營養(yǎng)性和誘導(dǎo)軸突生

19、長，在本實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成熟神經(jīng)細(xì)胞分化，促進(jìn)分化的細(xì)胞產(chǎn)生軸突，使BDNF與細(xì)胞膜上的TrkB受體結(jié)合后可以激活一系列細(xì)胞生物反應(yīng)，促使骨髓基質(zhì)細(xì)胞從未分化狀態(tài)的細(xì)胞向成熟神經(jīng)元發(fā)育和分化。骨髓基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)后的神經(jīng)細(xì)胞應(yīng)該是分化成熟的、有功能的細(xì)胞，BDNF可促進(jìn)TGF-誘導(dǎo)后的細(xì)胞成熟和轉(zhuǎn)化率的提高，該方法可能為細(xì)胞移植治療脊髓損傷提供一種高效種子細(xì)胞生產(chǎn)方法?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 梅晰凡，范廣宇. 細(xì)胞移植治療脊髓損傷J. 中國臨床康復(fù)，2003，32（7）：4384-4385.2 Xu X,Sun B,Mu LL,et al.Study on therapy of experime

20、ntal autoimmune neuritis by bone marrow stromal cellsJ.Atricle in Chinese,2007,23(1):52-55.3 張鵬飛，張亞卓，李慶國，等.bFGF、EGF誘導(dǎo)成人骨髓基質(zhì)細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究J.中華神經(jīng)外科雜志，2005，21（8）：497-499.4 易誠青，張明貴，曹云. 骨髓基質(zhì)細(xì)胞與交聯(lián)明膠一聚羥基丁酸酯膜的生物相容性研究J. 中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2006，15（3）：261-265.5 鄭殿魁，王爽，張朝東. 骨髓基質(zhì)細(xì)胞與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和修復(fù)J. 中國臨床康復(fù)，2005，9（22）：194-195.6 Matrone C, Ciotti MT, Mercanti D, et alNGF and BDNF signaling control amyloidogenic route and Abeta pr