一種真核生物染色質(zhì)隔離子篩選方案的初步建立

1、    一種真核生物染色質(zhì)隔離子篩選方案的初步建立章波,王燕,許雪青,白云,楊曉亞(第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室,重慶400038)提要:目的探討建立染色質(zhì)隔離子的正負(fù)篩選工具的可行性。方法合成引物從雞基因組cHS4區(qū)域擴(kuò)增了1段特異的DNA,將PCR產(chǎn)物克隆到T-載體后測(cè)序,驗(yàn)證其對(duì)增強(qiáng)子的阻斷功能;對(duì)pEGFP-N1載體進(jìn)行一系列改造,評(píng)價(jià)其正負(fù)篩選效果。結(jié)果成功地獲得已知的隔離子片段,初步結(jié)果表明該片斷能阻斷增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄激活作用。將TK基因作為負(fù)向篩選標(biāo)記引入pEGFP-N1載體后獲得了改造后的載體,轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞經(jīng)過(guò)G418篩選10

2、d后獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系,在不同濃度GCV藥物作用下細(xì)胞殺傷效果有差異。結(jié)論正負(fù)篩選方法被成功地引入到篩選系統(tǒng),為進(jìn)一步進(jìn)行染色質(zhì)隔離子的篩選與利用奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞:染色質(zhì)隔離子;增強(qiáng)子;基因表達(dá)中圖法分類(lèi)號(hào):Q756;Q78文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:AConstruction of screen system for chromosome insulator in eukaryotesZHANG Bo,WANG Yan,XU Xue-qing,BAIYun,YANG Xiao-ya(Department ofMedicalGenetics,College ofMedicine,ThirdMilitar

3、yMedicalUniversity,Chongqing 400038,China)Abstract:ObjectiveTo further investigate the function of chromatin insulators and to constructa screensystem for chromatin insulators.MethodsA primer set targeting chicken cHS4 locuswas designed and synthesized. The specific PCR productusing this primer setw

4、as obtained and sequenced. In order to test its blocking activity,we further inserted this fragmentbetween enhancerand promotor. ThenTK genewas inserted intomodified pEGFP-N1 plasmid,whichwas tested for its negative and positive selection.ResultsThe result ofluciferase activity showed that insulator

5、s could functionwhen itwas located on plasmid. Then vectorpEGFP-N1wasmodified as a screening system for chromatin insulator,inwhich phosphotransferase gene and thymidine kinase gene could function as selectionmarker. In order to evaluate its efficiency and viability,the recombinantvectorwas transfec

6、ted into COS-7 cells. After selected with G418 for 10 d,stable transfected cellswith G418resistancewere obtained. The sensitivity to pro-drug ofGCV of these cellswas different from thatof its controlcells byMTT.ConclusionThis study provides an early research to further screen and utilize chromatin i

7、nsulator in eukaryotes.Key words:chromatin insulator;enhancer;gene expression隨著人類(lèi)基因組測(cè)序工作的基本結(jié)束,人類(lèi)基因組所擁有的基因數(shù)目比預(yù)計(jì)的要少,基因組包含了更多的調(diào)控序列1,因而,對(duì)基因組中調(diào)控序列的鑒定工作就顯得日益重要。最近的研究顯示,真核基因組中的染色質(zhì)隔離子對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控具有重要的調(diào)控作用2, 3。隔離子是基因組中的一段特異DNA序列,具有2個(gè)基本功能:一是增強(qiáng)子阻斷活性;其二是位置效應(yīng)保護(hù)作用4。為了深入研究染色質(zhì)隔離子的分布和功能,就必須有一個(gè)能篩選隔離子的工具。我們?cè)谖墨I(xiàn)的追蹤中發(fā)現(xiàn):可以在附加

8、體(質(zhì)粒)上對(duì)染色質(zhì)隔離子的功能進(jìn)行研究。盡管主要的研究方法大多在染色質(zhì)水平上進(jìn)行,但有的研究是在基因組外的附加體上進(jìn)行的。研究證明:轉(zhuǎn)座因子gypsy內(nèi)的隔離子在質(zhì)粒上也可以阻斷增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄激活作用,而不必將重組基因整合到染色體上5。同樣,Krebs6在質(zhì)粒上分析scs和scs對(duì)增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄激活的阻斷,發(fā)現(xiàn)隔離子在發(fā)揮作用時(shí)不必整合在染色體上。因而,我們有可能基于質(zhì)粒來(lái)構(gòu)建一個(gè)體外的篩選體系,鑒定那些具有染色質(zhì)隔離子功能的DNA序列。研究表明:在雞血紅蛋白基因5端有4個(gè)DNA酶敏感位點(diǎn)(hypersensitivity sites, HS),其中cHS4區(qū)域存在1個(gè)隔離子7。為了建立一個(gè)能夠篩

9、選真核生物隔離子的體系,需要獲得已知具有隔離子功能的DNA片段,本研究首先根據(jù)已知的序列設(shè)計(jì)PCR引物,分別從小鼠和雞基因組中克隆出相應(yīng)的具有隔離子功能的片段,然后將其插入到報(bào)告質(zhì)粒的增強(qiáng)子與啟動(dòng)子之間,比較其對(duì)報(bào)告基因表達(dá)的影響,以期初步證實(shí)其功能,然后進(jìn)一步利用這些隔離子改造表達(dá)載體。1材料與方法1. 1材料重慶肉雞購(gòu)自重慶種雞場(chǎng)。人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480細(xì)胞、COS-7細(xì)胞為本室保存。基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自博大泰克公司,DNA凝膠回收試劑盒、DNA連接試劑盒、限制性?xún)?nèi)切酶、高保真Taq多聚酶均為大連寶生物公司產(chǎn)品, pGL3系列載體及熒光素酶活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自Promega公司; GC

10、V為Roche產(chǎn)品,脂質(zhì)體Lipofectamine2000為Invitrogen產(chǎn)品。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純度。1. 2方法1. 2. 1基因組DNA提取取雞肝臟組織,加入預(yù)冷PBS進(jìn)行勻漿處理,離心后收集細(xì)胞,用預(yù)冷PBS洗2次,以試劑盒提供的TE溶液重懸細(xì)胞,然后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。提取的DNA經(jīng)電泳觀察及紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度。1. 2. 2PCR擴(kuò)增隔離子及產(chǎn)物克隆以雞基因DNA為模板, PCR擴(kuò)增目的DNA。擴(kuò)增雞cHS4片段的引物為CP1: 5-CTAGAGGGACAGCCCCCCCCCAAAG-3, CP2: 5-CCCATCCT-CACTGACTCC GTCCTGG-3。

11、反應(yīng)條件為: 94變性5 min,9430 s, 5530, 724 min,共32個(gè)循環(huán),最后在72保溫10 min。產(chǎn)物大小為1. 6 kb, PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后與T-載體連接并轉(zhuǎn)化E. coli.DH5,篩選白色菌落進(jìn)行鑒定、測(cè)序。1. 2. 3增強(qiáng)子陽(yáng)性對(duì)照載體的構(gòu)建采用PCR方法以pGL3-control質(zhì)粒為模板擴(kuò)增SV40增強(qiáng)子部分。引物為SVP1: 5-CAGAGCTCGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGG-3,SVP2: 5-GCGA GCTCTCTGAACGATGGAGCGGAGAATGGG-3。產(chǎn)物大小為240 bp,純化的PCR產(chǎn)物酶切后連接到pGL3-P

12、ro-motor的Sac位點(diǎn),并測(cè)序證實(shí),命名為pGL3-EP。1. 2. 4隔離子功能分析載體的構(gòu)建采用Xho和Nhe從測(cè)序證實(shí)的T-載體上切下片段,然后連接到pGL3-EP,獲得pGL3-cHS4P。1. 2. 5SW480細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞培養(yǎng)按照常規(guī)操作,使用DMEM培養(yǎng)基。提取構(gòu)建好的各種質(zhì)粒,測(cè)定DNA濃度以備轉(zhuǎn)染。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種至24孔板, 105/孔,37培養(yǎng)12 h后按照脂質(zhì)體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。1. 2. 6報(bào)告基因的表達(dá)測(cè)定轉(zhuǎn)染后24 h,吸出培養(yǎng)基,用預(yù)冷的PBS洗2次。每孔加入裂解緩沖液200,l收集液體,于液氮中反復(fù)凍融3次,然后12 000 r/mi

13、n,離心15 min,取上清測(cè)定蛋白濃度和熒光素酶活性。以單位蛋白質(zhì)中熒光素酶活性來(lái)表示基因表達(dá)強(qiáng)度。1. 2. 7TK基因的克隆根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(kù)中的記錄,設(shè)計(jì)擴(kuò)增TK基因編碼區(qū)的引物。TKP1: CAGAAGCTTATGGCTTCG-TACCC TGC;TKP2:AGTCTAGATCAGTTAGCCTCCCCCATC, PCR產(chǎn)物大小為1. 2 kb。含TK基因編碼區(qū)的質(zhì)粒由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所陳林教授贈(zèng)送。以此質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),然后將產(chǎn)物純化后克隆至T-載體,進(jìn)行序列測(cè)定。在此基礎(chǔ)上將TK基因編碼區(qū)克隆至pGL3載體,最后克隆至目的載體,獲得可供隔離子篩選的重組質(zhì)

14、粒。1. 2. 8COS-7細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞培養(yǎng)按照常規(guī)操作,使用RPMI1640培養(yǎng)基,添加10%小牛血清。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的COS-7細(xì)胞傳代至6孔板,當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿60%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照脂質(zhì)體的說(shuō)明進(jìn)行。轉(zhuǎn)染完成以后換液,加入G418 (600g/ml)繼續(xù)培養(yǎng),適時(shí)換液。當(dāng)抗G418細(xì)胞獲得后,降低G418濃度為300g/ml。1. 2. 9GCV藥物對(duì)COS-7細(xì)胞的殺傷作用GCV濃度分別設(shè)定為0、0.03、0.1、0.3、1、3、10、50g/ml。將G418抗性的COS-7細(xì)胞傳代至96孔板,104/孔。細(xì)胞貼壁后加入含不同濃度GCV的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)96 h后進(jìn)行

15、MTT測(cè)定。以不加入GCV藥物的細(xì)胞吸光值作為對(duì)照,計(jì)算GCV對(duì)細(xì)胞的殺傷作用。2結(jié)果2. 1cHS4片段的克隆按照基因組DNA提取方法從肉雞肝臟可以提取出肉雞基因組DNA,經(jīng)過(guò)PCR方法可以獲得單一的DNA帶(圖1)。將產(chǎn)物克隆至pMD-T載體后測(cè)序后表明:我們獲得了1段具有隔離子功能的DNA片段,全長(zhǎng)為1 650 bp,其序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中序列相似性為94%,估計(jì)與不同種屬有關(guān)。1:標(biāo)準(zhǔn);2:PCR產(chǎn)物圖1瓊脂糖電泳鑒定RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2. 2熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體的改建在文獻(xiàn)中報(bào)道:隔離子位于啟動(dòng)子與增強(qiáng)子間時(shí)可以阻斷增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄激活作用。因此,我們考慮在pGL3-Promotor載體

16、的啟動(dòng)子前加1個(gè)SV40的增強(qiáng)子部分作為轉(zhuǎn)錄激活的陽(yáng)性對(duì)照。采用的方法為PCR擴(kuò)增SV40啟動(dòng)子序列,然后連接到載體pGL3-Promotor之Sac位點(diǎn)。我們的結(jié)果顯示: SV40啟動(dòng)子序列被成功地?cái)U(kuò)增并且連接到pGL3-Promotor載體上,這被隨后的測(cè)序所證實(shí)。該載體命名為pGL3-EP,可進(jìn)一步用于1689隨后隔離子功能驗(yàn)證之中。在獲得具有隔離子功能的cHS4 DNA片段后,為了驗(yàn)證其功能需要將其插入陽(yáng)性對(duì)照載體。將重組于T-載體中cHS4片段插入到陽(yáng)性對(duì)照載體的Nhe與Xho位點(diǎn)之間(大小為1 600 bp),命名為pGL3-EcHS4P。獲得這些重組子以后大量制備質(zhì)粒DNA以備下

17、一步的細(xì)胞轉(zhuǎn)染。2. 3熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)分析將獲得的陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pGL3-EP、pGL3-cHS4P、pGL3-Pro-motor和陰性對(duì)照pGL-Control(啟動(dòng)子與增強(qiáng)子相距2. 0 kb)轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞,在分子數(shù)目相同的情況進(jìn)行轉(zhuǎn)染,然后測(cè)定熒光素酶活性。在SV40增強(qiáng)子存在的情況, pGL3-EP轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶活性為pGL3-Promotor所轉(zhuǎn)染細(xì)胞的8. 4倍,當(dāng)插入隔離子后,熒光素酶活性約為pGL3-Promotor所轉(zhuǎn)染細(xì)胞的2倍,使增強(qiáng)子的功能得到4倍的降低,而以pGL3-Control為陰性對(duì)照組的熒光素酶活性約為pGL3-Promotor組的7. 2倍(

18、圖2)。這說(shuō)明插入的隔離子序列起到一定的作用。圖2轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶活性測(cè)定2. 4具有正負(fù)篩選功能體系的建立根據(jù)預(yù)先的設(shè)計(jì),在我們所希望構(gòu)建篩選體系將利用Neo基因進(jìn)行正篩選,利用TK基因進(jìn)行負(fù)篩選。根據(jù)核酸數(shù)據(jù)庫(kù)的記錄,我們?cè)O(shè)計(jì)了TK基因的引物,以獲贈(zèng)的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),然后將其克隆至T-載體測(cè)序。結(jié)果顯示:所克隆的TK基因編碼框與預(yù)期完全一致,命名為pUC-TK。以TK基因編碼區(qū)替代pGL3-EP和pGL3-Promotor的熒光素酶報(bào)告基因,然后再克隆至pEGFP-N1載體中,從而獲得了p-EP-TK和p-Pro-TK。這兩個(gè)載體既有Neo基因用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的正向篩選,也有TK

19、基因用于負(fù)篩選,而p-EP-TK中TK基因的表達(dá)受控于增強(qiáng)子。若增強(qiáng)子的作用被阻斷,則TK基因的表達(dá)只有較低的本底水平。2. 5TK基因功能的檢測(cè)獲得用于隔離子篩選的重組質(zhì)粒以后,將p-EP-TK轉(zhuǎn)染至COS-7細(xì)胞,同時(shí)也轉(zhuǎn)染p-Pro-TK作為對(duì)照。細(xì)胞的轉(zhuǎn)染按照常規(guī)操作,轉(zhuǎn)染完成后立即更換為含G418的培養(yǎng)基。在更換培養(yǎng)基后48 h,即可觀察到大量的細(xì)胞死亡。5 d后,可見(jiàn)細(xì)胞團(tuán)生長(zhǎng); 10 d后抗G418的細(xì)胞得到大量擴(kuò)增。此時(shí)將G418濃度減半,在以后的細(xì)胞培養(yǎng)中均以此濃度進(jìn)行。細(xì)胞分別命名為COS-ETK和COS-PTK。大量獲得轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,分別測(cè)定其對(duì)TK基因的作用底物(GCV)

20、的反應(yīng)性。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)定了8個(gè)GCV濃度梯度。分別在GCV作用4 d以后測(cè)定各組的吸光值。從表1可以看出在高濃度GCV(大于1g/ml)作用下, 2種細(xì)胞被殺傷超過(guò)50%,最低達(dá)到34% (COS-ETK)和36. 8% (COS-PTK)。而在相對(duì)較低濃度的GCV藥物作用下, 2株轉(zhuǎn)染細(xì)胞被殺傷的比例有一定差別。在0. 1g/ml的GCV作用下, COS-ETK細(xì)胞被殺傷比例為70%,而COS-PTK細(xì)胞被殺傷比例為89. 6%。這說(shuō)明2株轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)GCV藥物的反應(yīng)是有差別的,與其TK基因表達(dá)量密切相關(guān)。表1不同GCV濃度(1g/m l)作用下細(xì)胞的相對(duì)存活率細(xì)胞的相對(duì)存活率細(xì)胞類(lèi)型0 0.

21、03 0. 1 0. 3 1 3 10 50COS-PTK 100 95. 6 89. 6 68. 7 51. 1 48. 2 38. 9 36. 8COS-ETK 100 90. 1 70. 0 55. 7 49. 1 45. 3 36. 4 34. 03討論隨著人類(lèi)基因組測(cè)序的完成,人們可以獲得了全基因組的框架序列,并且對(duì)這些序列進(jìn)行了解析,人類(lèi)所擁有的全部基因大約為34萬(wàn)個(gè)。這些基因的編碼序列在人類(lèi)基因組中所占的比例約為3%,更多的序列則為調(diào)控序列。在這些調(diào)控序列中包含了啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子,以及隔離子序列。對(duì)染色質(zhì)隔離子的研究起步于1985年,人們就在果蠅的染色體87A7的兩側(cè)發(fā)現(xiàn)了

22、scs和scs(specialized chromatinstructures,特殊染色質(zhì)結(jié)構(gòu))8。而明確提出隔離子概念則在1991年,Kellum等9作了關(guān)于隔離子的最早研究報(bào)道。他們根據(jù)這樣的假設(shè)來(lái)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn):隔離不同轉(zhuǎn)錄功能區(qū)的邊界元件可以抑制增強(qiáng)子對(duì)同一轉(zhuǎn)錄功能區(qū)中的基因的轉(zhuǎn)錄激活活性。從而發(fā)現(xiàn)了果蠅中的隔離子scs和scs。隨后在其他生物中也發(fā)現(xiàn)了隔離子的存在。隔離子的重要功能在于將整個(gè)基因組分隔成不同轉(zhuǎn)錄活性的區(qū)域。這與高等生物的染色質(zhì)組裝是相一致的10。因此,在某些時(shí)候,隔離子也被稱(chēng)為邊界元件。在高等真核生物中,基因的表達(dá)有明顯的時(shí)空特異性,且基因組中表達(dá)強(qiáng)弱部分間交替存在。若沒(méi)有

23、隔離子的存在,難以使基因表達(dá)得到精確控制。在基因組測(cè)序完成的今天,擺在人們面前的一個(gè)重要問(wèn)題就是:在人類(lèi)基因組中有多少個(gè)隔離子的存在?它們?cè)谡麄€(gè)基因組中是如何分布的?要回答這樣的問(wèn)題,人們必須有一個(gè)有效的分離鑒定隔離子的工具。本研究在這方面進(jìn)行了初步的探討,試圖能得到一個(gè)可以對(duì)基因組進(jìn)行有效篩選的工具。我們根據(jù)隔離子的功能特點(diǎn),設(shè)計(jì)了一個(gè)可以在真核細(xì)胞中進(jìn)行正負(fù)篩選的體系。由于隔離子功能的發(fā)揮離不開(kāi)真核生物的環(huán)境,因此我們利用其對(duì)基因表達(dá)的一個(gè)“抑制”作用來(lái)設(shè)計(jì)。(實(shí)際上:隔離子對(duì)基因的表達(dá)沒(méi)有增強(qiáng),也沒(méi)有沉默作用,只是在此篩選體系中對(duì)增強(qiáng)子的阻斷而顯示出抑制效果。)我們首先對(duì)已知具有隔離子功

24、能的DNA片段進(jìn)行了初步的驗(yàn)證。文獻(xiàn)報(bào)道:可以在質(zhì)粒上研究隔離子的功能,而不必在染色質(zhì)水平上進(jìn)行。Krebs在質(zhì)粒上分析scs和scs對(duì)增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄激活的阻斷,發(fā)現(xiàn)隔離子在發(fā)揮作用時(shí)不必整合在染色體上。這樣的研究結(jié)果給予我們很大的提示:可以基于質(zhì)粒構(gòu)建體外的隔離子篩選體系。然而,對(duì)于這樣的研究報(bào)道,我們還需要在實(shí)驗(yàn)體系中對(duì)此加以證實(shí)。我們的結(jié)果也初步證實(shí)這樣的結(jié)論:隔離子可以在質(zhì)粒上發(fā)揮其功能。進(jìn)入到細(xì)胞核的質(zhì)粒,實(shí)際上是與組蛋白相結(jié)合的,形成所謂的核小體結(jié)構(gòu)。這樣的結(jié)構(gòu)與真核生物染色質(zhì)結(jié)構(gòu)是相類(lèi)似的。因而,位于質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中的隔離子對(duì)增強(qiáng)子或沉默子等的阻斷作用與存在于復(fù)雜結(jié)構(gòu)的染色質(zhì)中的隔離子類(lèi)似

25、。故可以在質(zhì)粒這樣的小分子中分析隔離子的阻斷作用。TK(胸苷激酶)能將無(wú)毒的GCV藥物磷酸化成單磷酸GCV,繼而在哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞激酶的共同催化下轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒物質(zhì)三磷酸-GCV11。該基因也廣泛被應(yīng)用到基因治療的負(fù)選擇系統(tǒng)中。借助組織特異性啟動(dòng)子還可以將TK基因限制在某些類(lèi)型細(xì)胞中表達(dá)。在無(wú)藥存在的情況下, TK基因的表達(dá)對(duì)細(xì)胞沒(méi)有損害,故可以形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。在一定量的前藥GCV存在時(shí),細(xì)胞毒性作用與TK基因表達(dá)量是成正比的。因此,可以控制前藥GCV的用量來(lái)區(qū)別不同表達(dá)活性TK基因的細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)中,由于SV40啟動(dòng)子本身有較好的轉(zhuǎn)錄活性,使得本底表達(dá)水平較高,GCV殺傷細(xì)胞的差別不理想。在

26、以后的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該選取轉(zhuǎn)錄活性較弱的啟動(dòng)子進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)有待進(jìn)一步改進(jìn)。參考文獻(xiàn):1 LanderE S, Linton LM, Birren B,etal. Initial sequencing and analysis of the human genome J. Nature, 2001, 409 (6822): 860 -921.2章波,劉昕.染色質(zhì)隔離子研究進(jìn)展 J.遺傳, 2004, 26(4): 551-555.3 MajumderP, CaiH N. The functional analysis of insulator interactionsin the Drosophila

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