深低溫保存人視網(wǎng)膜的酶組織化學及超微結(jié)構(gòu)觀察

1、    深低溫保存人視網(wǎng)膜的酶組織化學及 超微結(jié)構(gòu)觀察        【摘要】目的觀察深低溫保存不同時期人視網(wǎng)膜的酶組織化學及超微結(jié)構(gòu)變化。方法以酶組織化學染色法測定深低溫保存不同時期（275、704d）及對照組視網(wǎng)膜琥珀酸脫氫酶（succinic dehydrogenase, SDH）、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase, LDH）、腺苷三磷酸酶（ATPase）活性，并觀察視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)改變。結(jié)果深低溫保存不同時期及對照組的人視網(wǎng)膜SD

2、H、LDH及ATPase活性差異無顯著性意義；光鏡下見深低溫保存組視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層、外網(wǎng)層及桿錐層積液略多；透射電鏡下神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)正常，細胞核形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常，線粒體不同程度腫脹，個別空泡形成。結(jié)論深低溫法是視網(wǎng)膜的活性保存方法之一，有望為臨床視網(wǎng)膜移植提供材料?！娟P(guān)鍵詞】視網(wǎng)膜/超微結(jié)構(gòu);低溫保存;組織學;組織移植中分類號：R774R318.52R322.91文獻標識碼：A文章分類號：1005-1015（2000）03-0198-04 An observation on enzymic histochemistry and ultrastructureof cryopreserved huma

3、n retinal epitheliumXU HaifengWANG ChuanfuCHEN Meiling（Department of Ophthalmology, the Affiliated Hospital, Medical School, Qingdao University, Qingdao 266000, China）【Abstract】ObjectiveTo observe the enzymic histochemical and ultrastructral changes of cryopreserved human retina.MethodsTo compare th

4、e activity of lactate dehydrogenase (LDH)， succinate dehydrogenase (SDH) and ATPase in cryopreserved retina with those in fresh retina and to observe the histological and ultrastructural changes of cryopreserved retina.ResultsThere was no statistical difference between the activity of LDH， SDH and A

5、TPase in fresh and in cryopreserved retina. Histologically, in the cryopreserved retina, fluid in neural fiber and outer plexiform layers, as well as in cone and rod layer, was sligthly more than normal. The ultrastructure is normal except that the mitochondria was swollen in different degree.Conclu

6、sionCryopreservation may be an effective method for keeping the retinal cells alive for a long period and might free the transplantation from dependance on aviability of fresh dornor tissue.【Key Words】Retina/ultrastructure;Cryopreservation;Histology;Tissue transplantation深低溫法是組織活性保存的有效方法之一。我們在深低溫長期保

7、存角膜、結(jié)膜及鞏膜1-3獲得成功的基礎(chǔ)上采用深低溫保存視網(wǎng)膜，對視網(wǎng)膜的活性保存方法進行初步探討，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。1材料和方法1.1取材視網(wǎng)膜來源于2648歲供體，猝死后2 h內(nèi)行眼球摘除，4濕房保存，4 h內(nèi)完整取出視網(wǎng)膜。1. 2深低溫保存及復溫視網(wǎng)膜取材后采用簡化二步法1保存，保存期為275d及704d各3只。復溫時將冷凍瓶從液氮中取出，放入40水浴復溫約1 min，待視網(wǎng)膜表面僅殘留一層薄冰時，取出視網(wǎng)膜置于平衡液中漂洗備用。1.3酶組織化學觀察將深低溫保存不同時期后復溫的視網(wǎng)膜及對照組視網(wǎng)膜3只（未經(jīng)深低溫保存，視網(wǎng)膜來源及制作方法與深低溫保存組相同）展平于載玻片上，取赤道部視網(wǎng)膜

8、約5mm×5mm，低溫恒冷切片箱切成8m厚的切片，同一條件下孵育，同時另取切片行方法對照，方法見表1。所有酶組織化學染色切片均以VIDAS像分析系統(tǒng)定量測定視網(wǎng)膜所含酶活性，酶活性大小以平均光密度值代表。同時取5mm×5mm及2mm×2mm大小赤道部視網(wǎng)膜分別置于快速固定液（95%酒精福爾馬林丙醋酸=1541）及43%戊二醛中固定，以備行組織學及電鏡檢查。1.4組織學檢查將經(jīng)快速固定液固定2h視網(wǎng)膜常規(guī)石蠟包埋，HE染色后行光鏡組織學檢查；將經(jīng)3%戊二醛固定12h的視網(wǎng)膜標本用0.01mol/LPBS充分漂洗，1%鋨酸后固定，遞增濃度的酒精脫水，Epon812環(huán)氧

9、樹脂浸透、包埋，制超薄片后醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，JEM-1200EX透射電鏡觀察、照相并記錄。表1視網(wǎng)膜酶組織化學染色方法Tab.1Retinal enzymic histochemical staining method酶Enzyme底物SubstratepH溫度Temperature()孵育時間Stainingduration方法對照Methodcontrol方法來源Stainingaccordingto試劑來源Agentsproduced by琥珀酸鈉去底物北京化學試劑二廠SDHSodiumsuccinate7.83730minDo not addsubstrateLojda4Bei

10、jing 2ndchemicalplant乳酸鈉去輔酶北京化學試劑二廠LDHSodiumlactate7.6375minDonot addCoenzymeILojda4Beijing 2ndchemicalplant腺苷三磷酸鈉去底物北京化學試劑二廠ATPaseSodiumadenotriphosphate9.23740minDo not addsubstrateWachstein5Beijing 2ndchemicalplant表2深低溫保存不同時期視網(wǎng)膜LDH、SDH、ATPase活性(±s)Tab.2The activity of LDH、SDH、ATPase in cryop

11、reserved human retina (±s)LDHSDHATPase對照組Control group1.52±0.12421.06±0.02391.37±0.090保存275dPreserved for 275 days1.46±0.08571.01±0.03531.31±0.035保存704dPreserved for 704 days1.55±0.11040.99±0.05331.30±0.043F value0.8563.5452.420P value> 0.05> 0

12、.05> 0.052結(jié)果2.1酶組織化學染色結(jié)果LDH、SDH、ATP酶的反應(yīng)產(chǎn)物分別為藍色、紫藍色及棕黑色顆粒。其中LDH、SDH主要分布于神經(jīng)節(jié)細胞層、神經(jīng)纖維層及桿、錐體層，而ATP酶主要位于桿、錐體層(1，2)。本試驗對位于桿錐體層的以上各酶活性進行了比較。測定結(jié)果見表2。經(jīng)方差分析表明，保存不同時期的視網(wǎng)膜桿、錐體層各種酶活性與對照組相應(yīng)酶活性相比，差異無顯著性。2.2組織學檢查結(jié)果深低溫保存不同時期的視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰，排列正常，細胞核圓形或橢圓形，染色質(zhì)分布正常。與對照組相比，經(jīng)深低溫保存的視網(wǎng)膜見神經(jīng)纖維層、外網(wǎng)層及桿、錐體層中積液略多（3，4)。2.3超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果深

13、低溫保存的視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層見神經(jīng)纖維雙層膜結(jié)構(gòu)清晰、完整，微管、微絲存在（5）。神經(jīng)節(jié)細胞核膜完整，核周隙無擴大，染色質(zhì)分布均勻，胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無明顯脫顆粒及網(wǎng)池擴張，線粒體結(jié)構(gòu)完整，無明顯脫嵴現(xiàn)象，部分基質(zhì)電子密度降低。水平細胞核膜結(jié)構(gòu)正常，染色質(zhì)分布均勻，胞質(zhì)內(nèi)Kolmer器、核糖體結(jié)構(gòu)正常，線粒體見基質(zhì)電子密度降低（6)。外核層見細胞核為圓形或橢圓形，核膜完整，染色質(zhì)分布正常，深低溫保存與對照組視網(wǎng)膜無明顯區(qū)別。桿體內(nèi)節(jié)無明顯異常，錐體內(nèi)節(jié)線粒體基質(zhì)電子密度降低，個別線粒體中空泡形成。桿體外段盤膜排列基本正常。3討論自Royo等6報道了第1例視網(wǎng)膜移植以來，眾多學者對此項技術(shù)進行了大量

14、深入細致的研究，并取得了令人鼓舞的成績。視網(wǎng)膜移植應(yīng)用于臨床治療某些眼底病已指日可待。與所有的組織器官移植一樣，移植材料的來源及保存方法也成為一突出問題。深低溫保存法是組織活性保存的有效方法之一，已有研究7-8證明，經(jīng)深低溫保存的組織細胞，復蘇后仍具有較強的再生或增殖能力，臨床應(yīng)用取得了滿意療效。視網(wǎng)膜是代謝旺盛的神經(jīng)組織，對各種致病因子及外來理化因素刺激的抵抗力較弱，深低溫保存組織細胞是使其代謝和生命活動完全停止，即組織細胞處于休眠狀態(tài)，但仍保持其結(jié)構(gòu)的完整性和正常功能。一旦給予恢復細胞代謝活動的條件，細胞即可復蘇，恢復生命活動。但在冷凍及復溫過程中，組織細胞不可避免地要受到物理、化學、機械

15、性損傷，故本實驗采用視網(wǎng)膜酶活性及組織結(jié)構(gòu)改變作指標觀察深低溫保存后視網(wǎng)膜活性。結(jié)果表明，深低溫保存不同時期的視網(wǎng)膜與對照組視網(wǎng)膜相比，LDH、SDH、ATP酶活性差異均無顯著性，提示經(jīng)深低溫保存，視網(wǎng)膜的基本代謝功能仍能得以較完善保存。透射電鏡下見細胞核形態(tài)正常，多為圓形或橢圓形，核膜完整，核周隙無擴大，神經(jīng)節(jié)細胞、水平細胞核染色質(zhì)分布均勻，桿、錐體細胞核內(nèi)異染色質(zhì)較多，未見明顯染色質(zhì)邊集、核固縮、核膜破裂等不可逆損傷。表明經(jīng)深低溫保存后細胞核結(jié)構(gòu)維持正常。錐體內(nèi)節(jié)及節(jié)細胞等的細胞質(zhì)內(nèi)可見線粒體絕大多數(shù)結(jié)構(gòu)完整，無明顯脫嵴現(xiàn)象，但基質(zhì)部分電子密度降低很常見，個別有空泡形成，提示有不同程度損傷

16、。神經(jīng)纖維層也是對各種損傷較敏感的組織，損傷時表現(xiàn)為纖維腫脹、變性、微管微絲消失，本試驗中神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)基本正常，表明深低溫保存過程沒有對神經(jīng)纖維層造成重大損傷。 1對照組人視網(wǎng)膜SDH酶組織化學染色,位于桿錐體層的SDH反應(yīng)產(chǎn)物（黑箭）×400Fig.1Enzymic histochemistry stain of SDH in human retina of control group. Product of SDH in rod and cone layer(black arrow)×4002深低溫保存704天人視網(wǎng)膜SDH酶組織化學染色, 位于桿錐體層的SDH反應(yīng)產(chǎn)物

17、（黑箭）×400Fig.2Enzymic histochemistry stain of SDH in human retina having been cryopreserved for 704 days. Product of SDH in rod and cone layer(black arrow) ×4003對照組人視網(wǎng)膜HE×400Fig.3Human retina in control groupHE×4004深低溫保存704天人視網(wǎng)膜，光鏡下見視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰，但外網(wǎng)層（OR）及桿錐體層（RC）積液略多（黑箭）HE×400Fi

18、g.4Human retina having been cryopreserved for 704 days. Under light microscope, the retina is normally divided in to 9 layers. In outer reticular layer (OR) and rod & cone layer (RC), the fluid is a bit more than that in control group (black arrow)HE×4005深低溫保存704天人視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層。電鏡下見神經(jīng)纖維雙層膜結(jié)構(gòu)清晰（黑

19、箭），微管微絲存在醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色×20Fig.5The neurofiber layer of human retina having been cryopreserved for 704 days. Under electron microscope, the bilayer structure is clear (black arrow), microcanaliculi and microfiber also can be seen. Uranyl acetate and lead citrate stain×206深低溫保存704天人視網(wǎng)膜水平細胞。電鏡下

20、見核膜完整（黑箭），染色質(zhì)（C）分布均勻，細胞質(zhì)內(nèi)可見Kolmer器（K）醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色×20Fig.6Horizontal cell in human retina having been cryopreserved for 704 days. Under electron microscope, the nuclear membranc is intact (black arrow), the chromatin is homogeneous (C), Kolmer body (K) exit in cytoplasma. Uranyl acetate and lead

21、 citrate stain×20以上結(jié)果表明，經(jīng)深低溫保存后，視網(wǎng)膜仍具有基本正常的結(jié)構(gòu)與代謝功能。但能否代替新鮮視網(wǎng)膜應(yīng)用于視網(wǎng)膜移植研究以至臨床治療，尚需進一步從細胞培養(yǎng)、深低溫保存動物視網(wǎng)膜移植等方面進行深入研究。作者單位：王傳富（266000 青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院眼科）孫為榮（266000 青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院眼科）徐海峰（煙臺毓璜頂醫(yī)院眼科）陳美玲（煙臺毓璜頂醫(yī)院眼科）黃萍（煙臺市牟平區(qū)中醫(yī)院眼科）4參考文獻1，王傳富,鞠明誠,石珍榮,等.深低溫長期保存角膜穿透性移植的研究J.中華眼科雜志,1990,26:17-202，王傳富,孫為榮,王大博,等.深低溫長期保存結(jié)膜的實驗和臨床研究J.青島醫(yī)學院學報,1997,33:290-292.3，王傳富,孫為榮,王大博,等.深低溫長期保存鞏膜的動