醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)免疫學(xué)實驗指導(dǎo)

1、醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)免疫學(xué)實驗指導(dǎo)主編金伯泉 李恩善免疫血清的制備淋巴細胞雜交瘤單克隆抗體技術(shù)免疫球蛋白純化技術(shù)鹽析法純化免疫球蛋白DEAE-Sephadex A-50柱層析純化免疫球蛋白SPA-Sepharose CL-4B 親和層析純化IgG及IgG亞類高效液相色譜純化小鼠腹水中單克隆抗體單克隆抗體親和層析柱純化重組人2a干擾素(rHuIFN-2a)免疫球蛋白標(biāo)記技術(shù)酶標(biāo)記抗體熒光素標(biāo)記抗體技術(shù)125I標(biāo)記單克隆抗體技術(shù)標(biāo)記抗體的應(yīng)用ELISABA-ELISA免疫斑點試驗化學(xué)發(fā)光免疫分析125I標(biāo)記單克隆抗體競爭結(jié)合試驗細胞分離純化技術(shù)Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞Percoll不連續(xù)

2、密度梯度沉淀法分離純化淋巴細胞和淋巴母細胞溶血空斑形成試驗細胞表面標(biāo)記的檢測技術(shù)堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶(APAAP)免疫組化染色技術(shù)檢測淋巴細胞表面標(biāo)記活細胞免疫熒光技術(shù)流式細胞儀標(biāo)本的制備淋巴細胞增殖功能的測定人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞的分離培養(yǎng)與增殖試驗殺傷細胞功能的檢測自然殺傷細胞(NK)和淋巴因子激活殺傷細胞(LAK)的殺傷功能混合淋巴細胞培養(yǎng)細胞因子生物學(xué)活性的檢測白細胞介素-1生物學(xué)活性檢測Con A 刺激小鼠胸腺細胞檢測IL-1生物學(xué)活性應(yīng)用EL-4、CTLL檢測IL-1生物學(xué)活性白細胞介素-2生物學(xué)活性檢測白細胞介素-6生物學(xué)活性檢測干擾素生物學(xué)活性檢測腫瘤壞死因子-生物學(xué)活性檢測細

3、胞因子及其受體的免疫學(xué)方法檢測夾心法ELISA檢測人可溶性白細胞介素2受體(sIL-2R)夾心法ELISA檢測人白細胞介素8(IL-8)夾心法ELISA檢測人2a、2b干擾素(IFN-2a、2b)免疫血清的制備撰稿李恩善免疫血清的制備是一項常用的免疫學(xué)實驗技術(shù)。高效價、高特異性的免疫血清可作為免疫學(xué)診斷的試劑(如用于制備免疫標(biāo)記抗體等)，也可供特異性免疫治療用。免疫血清的效價高低取決于實驗動物的免疫反應(yīng)性及抗原的免疫原性。如以免疫原性強的抗原刺激高應(yīng)答性的機體，?？色@得高效價的免疫血清。而使用免疫原性弱的抗原免疫時，則需同時加用佐劑以增強抗原的免疫原性。免疫血清的特異性主要取決于免疫用抗原的純

4、度。因此，如欲獲得高特異性的免疫血清，必須予先純化抗原。此外，抗原的劑量、免疫途徑及注射抗原的時間間隔等，也是影響免疫血清效價的重要因素應(yīng)予重視。原理免疫方法放血分離血清結(jié)果鑒定材料注意事項一、原理具有免疫原性的抗原可刺激機體相應(yīng)B細胞增殖、分化形成漿細胞并分泌特異性抗體。由于抗原分子表面的不同決定簇為不同特異性的B細胞克隆所識別，因此由某一抗原刺激機體后產(chǎn)生的抗體，實際上為針對該抗原分子表面不同決定簇的抗體混合物(即多克隆抗體)。另外，抗體的產(chǎn)生具有回憶應(yīng)答的規(guī)律性，牨m現(xiàn)為初次免疫注射與再次免疫注射后的抗體應(yīng)答特點截然不同。這是由于記憶性B細胞參與再次應(yīng)答所致。二、免疫方法根據(jù)抗原的性質(zhì)不

5、同而異。下面以制備家兔抗人IgG免疫血清為例作具體說明。1.用剪刀剪去家兔兩后腳掌的部分兔毛，以酒精及碘酒消毒皮膚；2.第一次免疫: 用2ml注射器吸取弗氏完全佐劑(FCA)乳化的抗原(人IgG)下稱FCA-IgG)液1ml，每側(cè)腳掌皮下各注入0.5ml。3.第二次免疫：間隔10-14天后，于兩側(cè) 窩及鼠蹊部腫大的淋巴結(jié)內(nèi)注入FCA-IgG，每個淋巴結(jié)注0.1ml，其余注入淋巴結(jié)附近皮下共1ml。如淋巴結(jié)未腫大或腫大不明顯時，直接注入兩側(cè)窩及鼠蹊部皮下。4.間隔7-10天后，從耳靜脈采血0.51.0ml，分離血清，以雙相瓊脂擴散試驗測定免疫血清的抗體效價(即試血)。效價至少應(yīng)達到116以上時才

6、能放血。5.若效價未達到要求，可用不加佐劑的抗原液(人IgG)耳靜脈內(nèi)注射免疫。即于1周內(nèi)注射3次，分別為0.1、0.3、0.5ml。間隔1周再試血。如效價達到要求應(yīng)立即放血。另外,也可在第2次免疫后，以弗氏不完全佐劑(FIA)乳化的抗原(人IgG)(簡稱FIA-IgG)再免疫1-2次。注射部位、劑量和間隔均同第2次，再試血測抗體效價，如效價達到要求立即放血。三、放血(一)心臟采用血法1.家兔仰面，四肢縛于動物固定架上(或由助手抓住四肢固定)；2.剪去左胸部兔毛，消毒皮膚；3.用左姆指摸到胸骨劍突處，食指及中指放在右胸處輕輕向左推心臟，并使心臟固定于左胸側(cè)位置。然后，以左拇指觸摸心臟搏動最強的

7、部位；4.用50ml注射器(連接16號針頭)，傾針45°角度，對準(zhǔn)心搏最強處刺入心臟抽血致死；5.將抽取的血液立即注入無菌三角燒瓶中，待凝固后分離血清。(二)頸動脈放血法1.家兔仰臥同上固定。頭部略放低以暴露頸部。剃毛及消毒皮膚；2.沿頸部中線切開皮膚約10cm，分離皮下組織，直至暴露出氣管兩側(cè)的胸鎖乳突??；3.分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織，暴露出頸總動脈后使之游離；4.于動脈下套入兩根黑絲線，分別置于遠心及近心端。結(jié)扎遠心端的絲線。近心端的動脈用血管夾夾??；5.用尖頭小剪刀在兩根絲線間的動脈璧上剪一小口，插入塑料放血管。再將近心端的絲線結(jié)扎固定于放血管上，以防放血管滑脫

8、；6.松開血管夾，使血液流入滅菌三角燒瓶中。一般一只家兔可放血80100ml。四、分離血清將三角燒瓶的血置37溫箱1小時，再置4冰箱內(nèi)34小時。待血液凝固血塊收縮后，用毛細滴管吸取血清。于3000rpm離心15分鐘，取上清加入防腐劑(0.01硫柳汞或0.02疊氮鈉，最終濃度)，分裝后置4冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｎ?、結(jié)果鑒定以雙相瓊脂擴散試驗測定所獲免疫血清的抗體效價，并用瓊指免疫電泳鑒定免疫血清中抗體的質(zhì)量，應(yīng)產(chǎn)生單一的沉淀弧線。鑒定方法的具體步驟參見有關(guān)部分。六、材料(一)動物：健康成年家兔，雄性，體重23公斤。(二)器材：剪刀、鑷子、注射器(2ml、50ml)附針頭(9號、6號)、稱量瓶(10ml

9、)、量筒、動物固定架、滅菌三角燒瓶(200ml)、手術(shù)器械一套、血管夾、黑絲線、塑料放血管等。(三)試劑1.滅菌生理鹽水；2.純化人IgG(10mgml)；3.消毒酒精及碘酒；4.羊毛脂；5.石蠟油；6.活卡價苗(BCG)(75mgml)；7.弗氏不完全佐劑(FIA)制備：稱羊毛脂10克，逐滴加入優(yōu)質(zhì)石蠟油40ml，邊滴邊研磨，分裝于疫苗瓶中(每瓶10ml)，高壓滅菌(8磅20分鐘)后保存?zhèn)溆谩?.弗氏完全佐劑乳化抗原(FCA-IgG)的制備：將FIA予溫(6030分鐘)，吸取3ml于研缽中，逐滴加入活BCG(75mgml)0.5ml及純化人IgG2.5ml(2.4mgml)牨_滴入邊研磨直至

10、形成均一性的乳狀液，取1滴滴于冷水面上不散開為合格。七、注意事項1.免疫用實驗動物的抗體反應(yīng)性個體差異性較大，因此免疫時至少應(yīng)選用兩只以上動物。另外，不能使用妊娠動物。2.免疫用的抗原必須經(jīng)FCA或FIA充分乳化后才能注射，否則將明顯影響抗原的免疫效果。上述制備乳化抗原的方法較費時、費力。采用H-81微型振蕩混合器法或三腔管研磨法制備。前者是將抗原液與佐劑按比例混合后，置于混合器上使之劇烈振蕩(頻率2900轉(zhuǎn)分，振幅6mm)；后者是將免疫用的佐劑和抗原液按比例混合后，吸入注射器內(nèi)再將注射器連接于三腔管上反復(fù)抽吸研磨。這兩種方法約1小時即可使抗原充分乳化。3.佐劑一方面可提高特異性免疫反應(yīng)的效果

11、獲得高效價的免疫血清，但若抗原不純時，可使抗原中極微量的污染物(0.005mgN)產(chǎn)生抗體，以致導(dǎo)致免疫血清的純度受到影響。另外，有些實驗動物種系對BCG過敏，尤其是豚鼠其次是家兔，當(dāng)再次注射完全佐劑時,可以引起變態(tài)反應(yīng)而導(dǎo)致免疫失敗。為此，第二次免疫注射時應(yīng)減少佐劑中BCG的含量或改用不完全佐劑，以減少和防止變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生。4.抗原的劑量決定于抗原的種類。對免疫原性強的抗原劑量應(yīng)相別較少，免疫原性弱的抗原劑量可相對較多?？乖挠昧恳话阋泽w重計算。在使用佐劑的情況下，一次注入的總劑量以0.5mgkg體重為宜。如不加佐劑時劑量可加大10倍。另外，免疫周期長者可少量多次注射，免疫周期短者可較大量少

12、次注射。5.免疫方法上也可采用多點注射法免疫動物。即于家兔脊柱兩旁選4-6點皮下注射，同時于兩側(cè)肩部(或臂部)和鼠蹊部各注一處。每點注0.2ml，間隔2周后再于上述部位選不同點同上注射，也可產(chǎn)生高效價的免疫血清。淋巴細胞雜交瘤單克隆抗體技術(shù)撰寫劉雪松1975年，Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細胞和綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合，形成的雜交細胞既可產(chǎn)生抗體，又可無限增殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破不僅為醫(yī)學(xué)與生物學(xué)基礎(chǔ)研究開創(chuàng)了新紀(jì)元，也為臨床疾病的診、防、治提供了新的工具。制備單克隆抗體包括動物免疫、細胞融合、選擇雜交瘤、檢測抗體、雜交瘤細胞的克隆化、

13、凍存以及單克隆抗體的大量生產(chǎn)，要經(jīng)過幾個月的一系列實驗步驟，下面按照制備單克隆抗體的流程順序，逐一介紹其實驗方法。細胞融合前準(zhǔn)備細胞融合，選擇雜交瘤抗體的檢測雜交瘤的克隆化和凍存單克隆抗體的大量生產(chǎn)單克隆抗體的鑒定影響因素、失敗原因分析一、細胞融合前準(zhǔn)備(一)免疫方案選擇合適的免疫方案對于細胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般要在融合前兩個月左右確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。1.顆粒性抗原免疫性較強，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下面以細胞性抗原為例的免疫方案:初次免疫1×100.5ml ip (腹腔內(nèi)注射)23周后第二次免疫1

14、5;100.5ml ip3周后加強免疫(融合前三天)1×100.5ml ip或iv(靜脈內(nèi)注射)取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑，常用佐劑：福氏完全佐劑，福氏不完全佐劑。要求抗原和佐劑等體積混合在一起，研磨成油包水的乳糜狀，放一滴在水面上不易馬上擴散呈小滴狀表明已達到油包水的狀態(tài)。商品化福氏完全佐劑在使用前須振搖，使沉淀的分枝桿菌充分混勻。初次免疫 Ag150g加福氏完全佐劑皮下多點注射(一般0.81ml0.2ml點)3周后第二次免疫劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip(ip劑量不宜超過0.5ml)3周后第三次免疫劑量同上，不加佐劑，ip (57天后采血測其效價，檢測免

15、疫效果)23周后加強免疫，劑量50500g為宜，ip或iv3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原(特別是一些弱抗原)的免疫方案也不斷有所更新，如將可溶性抗原顆?；蚬滔嗷环矫嬖鰪娏丝乖拿庖咴?，另一方面可降低抗原的使用量。改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。使用細胞因子作為佐劑，提高機體的免疫應(yīng)答水平，促進免疫細胞對抗原反應(yīng)性。(二)飼養(yǎng)細胞在制備單克隆抗體過程中，許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細胞，如：在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)細胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細胞有：小鼠腹腔巨噬細胞(較為常用)、小鼠脾臟細胞或小鼠胸腺細胞，也有人用小鼠成纖維細胞系3T3經(jīng)放射線照射后作

16、為飼養(yǎng)細胞，使用比較方便，照射后可放入液氮罐長期保存，隨用隨復(fù)蘇。小鼠腹腔巨噬細胞的制備小鼠采用與免疫小鼠相同的品系，常用BaLbc小鼠610周齡拉頸處死浸泡于75酒精，消毒35分鐘用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜用無菌注射器注入68ml培養(yǎng)液反復(fù)沖洗，吸出沖洗液放入10ml離心管，1200轉(zhuǎn)分離心56分鐘用20小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細胞數(shù)1×10ml加入96孔板，100l孔放入37CO2孵箱培養(yǎng)一般飼養(yǎng)細胞在融合前一天制備，一只小鼠可獲得58×106腹腔巨噬細胞，若用小鼠胸腺細胞作為飼養(yǎng)細胞時，細胞濃度為5×106ml，小鼠脾細胞為

17、1×106ml，小鼠的成纖維細胞(3T3)1×105ml，均為100l孔。(三)骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞系應(yīng)和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤細胞在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAb。常用骨髓瘤細胞系有：NS1、SP20、X63 Ag8.653等。骨髓瘤細胞的培養(yǎng)適合于一般的培養(yǎng)液，如RPMI1640，DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在1020，細胞的最大密度不得超10ml，一般擴大培養(yǎng)以110稀釋傳代，每35天傳代一次。細胞的倍增時間為1620小時，上述三株骨髓瘤細胞系均為懸浮或輕微貼壁生長，只用彎頭滴管輕輕吹打即可懸起細胞。一般在準(zhǔn)備融合前的兩周就

18、應(yīng)開始復(fù)蘇骨髓瘤細胞，為確保該細胞對HAT的敏感性，每36月應(yīng)用8AG(8氮雜鳥嘌呤)篩選一次，以防止細胞的突變。保證骨髓瘤細胞處于對數(shù)生長期，良好的形態(tài)，活細胞計數(shù)高于95，也是決定細胞融合的關(guān)鍵。(四)免疫脾細胞免疫脾細胞指的是處于免疫狀態(tài)脾臟中B淋巴母細胞棗漿母細胞。一般取最后一次加強免疫3天以后的脾臟，制備成細胞懸液，由于此時B淋巴母細胞比例較大，融合的成功率較高。脾細胞懸液的制備：在無菌條件下取出脾臟，用不完全的培養(yǎng)液洗一次，置平皿中不銹鋼篩網(wǎng)上，用注射器針芯研磨成細胞懸液后計數(shù)。一般免疫后脾臟體積約是正常鼠脾臟體積的倍，細胞數(shù)為×10左右。二、細胞融合，選擇雜交瘤(一)細

19、胞融合流程(1)取對數(shù)生長的骨髓瘤細胞SP20，1000rpm離心5分鐘，棄上清，用不完全培養(yǎng)液混懸細胞后計數(shù)，取所需的細胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。(2)同時制備免疫脾細胞懸液，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。(3)將骨髓瘤細胞與脾細胞按110或15的比例混合在一起，在50ml塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗1次，1200rpm,8分鐘。(4)棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響PEG的濃度。(5)輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略加松動。(6)在室溫下融合:30秒內(nèi)加入預(yù)熱的1ml45PEG(Merek,分子量4000)含5DMSO，邊加邊攪拌。作用90秒鐘，若冬天室溫較低時可延長至120秒鐘。加預(yù)熱的

20、不完全培養(yǎng)液，終止PEG作用，每隔分鐘分別加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。(7)離心，800rpm，6分鐘。(8)棄上清，先用6ml左右20小牛血清RPMI1640輕輕混懸，切記不能用力吹打，以免使融合在一起的細胞散開。(9)根據(jù)所用96孔培養(yǎng)板的數(shù)量，補加完全培養(yǎng)液，10ml一塊96孔板。(10) 將融合后細胞懸液加入含有飼養(yǎng)細胞的96孔板，100l孔，37、5CO2孵箱培養(yǎng)。一般一塊96孔板含有1×107脾細胞。(二)HAT選擇雜交瘤應(yīng)用HAT 選擇培養(yǎng)液篩選雜交瘤細胞的原理已在研究生專題講座第六專題中已經(jīng)提到，這里主要介紹加HAT選擇培養(yǎng)的時間和濃度。一般

21、在融合24小時后，加HAT選擇培養(yǎng)液。HT和HAT均有商品化試劑50×貯存，用時1ml加入50ml20小牛血清完全培養(yǎng)液中。因為在培養(yǎng)板內(nèi)已加入飼養(yǎng)細胞、融合后的細胞，200l孔。所以在加選擇培養(yǎng)液時應(yīng)加3倍量的HAT。我們認為，融合后最初補加的量可用全量的23進行選擇，可得到滿意的篩選結(jié)果。50×HATH:5×10-3MA:2×10-5MT:8×10-4M一般選擇HAT選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)兩周后，改用HT培養(yǎng)液，再維持培養(yǎng)兩周，改用一般培養(yǎng)液。三、抗體的檢測篩選雜交瘤細胞通過選擇性培養(yǎng)而獲得雜交細胞系中，僅少數(shù)能分泌針對免疫原的特異性抗體。一般

22、在雜交瘤細胞布滿孔底110面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞系。檢測抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。常用的方法有:1.ELISA用于可溶性抗原(蛋白質(zhì))、細胞和病毒等McAb的檢測。2.RIA用于可溶性抗原、細胞McAb的檢測。3.FACS(熒光激活細胞分類儀)用于檢查細胞表面抗原的McAb檢測。4.IFA用于細胞和病毒McAb的檢測。上述方法均為一般實驗室的常規(guī)方法，故在此不介紹具體的實驗過程。可靠的篩選方法必須在融合前建立，避免由于方法不當(dāng)貽誤整個篩選時機。四、雜交瘤的克隆化和凍存克隆化一般是指

23、將抗體陽性孔進行克隆化。犚r為經(jīng)過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內(nèi)只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數(shù)個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞；所需要的抗體(特異性抗體)分泌細胞和其它無關(guān)抗體分泌細胞。要想將這些細胞彼此分開，就需要克隆化?？寺』脑瓌t是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆應(yīng)盡早進行克隆化，否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制，因為抗體非分泌細胞的生長速度比抗體分泌的細胞生長速度快，二者競爭的結(jié)果會使抗體分泌的細胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。(一)克隆化方案用克隆化的方法很

24、多，而最常用就是有限稀釋和軟瓊脂平板法。1.有限稀釋法的程序制備飼養(yǎng)細胞懸液(同融合前準(zhǔn)備)陽性孔細胞的計數(shù)，并調(diào)細胞數(shù)在15×10ml取130個細胞放入6.5ml含飼養(yǎng)細胞完全培養(yǎng)液，即20個細胞ml，100l孔加A、B、C三排為每孔2個細胞。余下2.9ml細胞懸液補加2.9ml含飼養(yǎng)細胞的完全培養(yǎng)液,細胞數(shù)為10個ml，100l孔加D、E、F三排，為每孔1個細胞。余下2.2ml細胞懸液補加2.2ml含飼養(yǎng)細胞的完全培養(yǎng)液，細胞數(shù)5個ml，100l孔，加G、H兩排，為每孔0.5個細胞。培養(yǎng)45天后，在倒置顯微鏡上可見到小的細胞克隆，補加完全培養(yǎng)液200l孔。第89天時，肉眼可見細胞

25、克隆，及時進行抗體檢測。注:初次克隆化的雜交瘤細胞需要在完全培養(yǎng)液中加HT。2.軟瓊脂法軟瓊脂的配制含20FCS(小牛血清)的2倍濃縮的RPMI16401瓊脂水溶液：高壓滅菌，42預(yù)熱。0.5瓊脂：由1份1瓊脂加1份含20小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42保溫。用上述0.5瓊脂液(含有飼養(yǎng)細胞)15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。按100ml，500ml或5000ml等濃度配制需克隆的細胞懸液。1ml 0.5瓊脂液(42預(yù)熱)在室溫中分別與1ml不同濃度的細胞懸液相混合?；靹蚝罅⒓磧A注于瓊脂基底層上，在室溫中10分鐘，使其凝固，孵育于37，5C

26、O2孵箱中。45天后即可見針尖大小白色克隆，710天后，直接移種至含飼養(yǎng)細胞的24孔板中進行培養(yǎng)。檢測抗體，擴大培養(yǎng)，必要時再克隆化。(二)雜交瘤細胞的凍存及時凍存原始孔的雜交瘤細胞、每次克隆化得到的亞克隆細胞是十分重要的。因為在沒有建立一個穩(wěn)定分泌抗體的細胞系的時候，細胞的培養(yǎng)過程中隨時可能發(fā)生細胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細胞的凍存，則因為上述的意外而全功盡棄。雜交瘤細胞的凍存方法同其他細胞系的凍存方法一樣，原則上細胞應(yīng)在每支安瓿含1×106以上，但對原始孔的雜交瘤細胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)長滿孔底時，一孔就可以凍一支安瓿。細胞凍存液

27、:50小牛血清40不完全培養(yǎng)液10DMSO(二甲亞砜)凍存液最好預(yù)冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降到0，再降溫時一般按每分鐘降溫23，待降至-70可放入液氮中?；蚣毎芙抵? 后放-70超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中。也可以用細胞凍存裝置進行凍存。凍存細胞要定期復(fù)蘇，檢查細胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性，在液氮中細胞可保存數(shù)年或更長時間。五、單克隆抗體的大量生產(chǎn)大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：1.體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細胞，從上清中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液含量為1060gml，如果大量生產(chǎn)，費用較高。2.體內(nèi)接種雜交瘤細胞，制備腹水或血清。實體瘤法對數(shù)生長期

28、的雜交瘤細胞按13×107ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2 ml, 共24點。待腫瘤達到一定大小后(一般1020天)則可采血，從血清中獲得單克隆抗體含量可達到1-10mgml。但采血量有限。腹水的制備常規(guī)是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液體石臘于BaLbc鼠，12周后腹腔注射1×106個雜交瘤細胞，接種細胞710天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲110ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達5-20mg/ml， 這是目

29、前最常用的方法，還可將腹水中細胞凍存起來，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水快、量多。六、單克隆抗體的鑒定對制備的McAb進行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的。應(yīng)對其做如下方面的鑒定:1.抗體特異性的鑒定：除用免疫原(抗原)進行抗體的檢測外，還應(yīng)用與其抗原成分相關(guān)的其它抗原進行交叉試驗，方法可用ELISA、IFA法。例如制備抗黑色素瘤細胞的McAb，除用黑色素瘤細胞反應(yīng)外，還應(yīng)用其它臟器的腫瘤細胞和正常細胞進行交叉反應(yīng)，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體。制備抗重組的細胞因子的單克隆抗體，應(yīng)首先考慮是否與表達菌株的蛋白有交叉反應(yīng)，其次是與其它細胞因子間有無交叉。2.McAb的Ig類與亞類的鑒定：一般

30、在用酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的第二抗體進行篩選時，已經(jīng)基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至于亞類則需要用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類血清系統(tǒng)作雙擴或夾心ELISA來確定McAb的亞類。在作雙擴試驗時，如加入適量的PEG(3)，將有利于沉淀線的形成。3.McAb中和活性的鑒定：用動物的或細胞的保護實驗來確定McAb的生物學(xué)活性。例如如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時接種于易感的動物或敏感的細胞，來觀察動物或細胞是否得到抗體的保護。4.McAb識別抗原表位的鑒定：用競爭結(jié)合試驗、測相加指數(shù)的方法，測定McAb所識別抗原

31、位點，來確定McAb的識別的表位是否相同。5.McAb親和力的鑒定：用ELISA或RIA競爭結(jié)合試驗來確定McAb與相應(yīng)抗原結(jié)合的親和力。七、影響因素、失敗原因分析由于制備McAb的實驗周期長，環(huán)節(jié)多，所以影響因素就比較多，稍不注意就會造成失敗。其主要失敗原因和影響因素有:1.污染：包括細菌、霉菌和支原體的污染。這是雜交瘤工作中最辣手的問題。一旦發(fā)現(xiàn)有霉菌污染就應(yīng)及早將污染板棄之，以免污染整個培養(yǎng)環(huán)境。支原體的污染主要來源于牛血清，此外，其它添加劑、實驗室工作人員及環(huán)境也可能造成支原體污染。在有條件的實驗室，要對每一批小牛血清和長期傳代培養(yǎng)的細胞系進行支原體的檢查，查出污染源應(yīng)及時采取措施處理

32、。對于污染的雜交瘤細胞可以采取生物學(xué)的過濾方法，將污染的雜交瘤細胞注射于BALBc小鼠的腹腔，待長出腹水或?qū)嶓w瘤時，犖菌取出分離雜交瘤細胞，一般可除去支原體污染。2.融合后雜交瘤不生長：在保證融合技術(shù)沒有問題的前提下主要考慮下列因素PEG有毒性或作用時間過長。牛血清的質(zhì)量太差，用前沒有進行嚴(yán)格的篩選。骨髓瘤細胞污染了支原體。HAT有問題，主要是A含量過高或HT含量不足。3.雜交瘤細胞不分泌抗體或停止分泌抗體融合后有細胞生長，但無抗體產(chǎn)生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤細胞發(fā)生突變，變成A抵抗細胞所致。有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。對于原分泌抗體的雜交瘤細胞變?yōu)殛幮裕赡苁羌毎гw污染，

33、或非抗體分泌細胞克隆競爭性生長，從而抑制了抗體分泌細胞的生長。也可能發(fā)生染色體丟失。Goding91982)曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗體停止分泌的有效措施。三要:要大量保持和補充液氮凍存的細胞原管。要應(yīng)用倒置顯微鏡經(jīng)常檢查細胞的生長狀況。要定期進行再克隆。三不要:不要讓細胞“過度生長”。因為非分泌的雜交瘤細胞將成為優(yōu)勢，壓倒分泌抗體的雜交瘤細胞。不要讓培養(yǎng)物不加檢查地任其連續(xù)培養(yǎng)幾周或幾個月。不要不經(jīng)克隆化而使雜交瘤在機體內(nèi)以腫瘤生長形式連續(xù)傳好幾代。4.雜交瘤細胞難以克隆化可能與小牛血清質(zhì)量、雜交瘤細胞的活性狀態(tài)有關(guān)，或由于細胞有支原體污染，使克隆化難以成功。若是融合后的早期克隆

34、化，應(yīng)在培養(yǎng)液加HT。免疫球蛋白純化技術(shù)撰稿金伯泉朱勇歐陽笑梅在大多數(shù)情況下，免疫血清、雜交瘤細胞培養(yǎng)上清以及腹水中的抗體需經(jīng)純化后再用于各種免疫學(xué)檢測中去。免疫球蛋白常用的純化方法有鹽析法、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析以及高效液相色譜等方法。這些方法各有優(yōu)缺點，應(yīng)根據(jù)抗體的特點、純度要求和實驗室具體條件加以選擇。鹽析法純化免疫球蛋白DEAE-Sephadex A-50柱層析純化免疫球蛋白SPA-Sepharose CL-4B 親和層析純化IgG及IgG亞類高效液相色譜純化小鼠腹水中單克隆抗體單克隆抗體親和層析柱純化重組人2a干擾素(rHuIFN-2a)鹽析法純化免疫球蛋白撰稿歐陽笑梅原理

35、主要材料鹽析的操作步驟影響鹽析的因素(一)原理蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度是由蛋白質(zhì)周圍親水基團與水形成水化膜的程度，以及蛋白質(zhì)分子帶有電荷的情況決定的。當(dāng)用中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液，中性鹽對水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失。同時，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后，由于離子強度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，更加導(dǎo)致蛋白溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。(二)主要材料1.試劑:(1)正常人混合血清；滅菌生理鹽水。(2)飽和硫酸銨溶液的配制:稱(NH4)2SO4(AR)400425克，以5080之蒸餾水500ml溶解，攪拌20分鐘，趁熱過濾。冷卻后以濃氨水(15NNH4

36、OH)調(diào)PH至7.4。配制好的飽和硫酸銨，瓶底應(yīng)有結(jié)晶析出。(3)萘氏試劑配制：稱HgI11.5克，KI8克，加蒸餾水至50ml，攪拌溶解后，再加入20NaOH 50ml。(4)0.02M, PH7.4磷酸鹽緩沖鹽液(Phosphate Buffered Saline PBS)配制:貯存液:A液：0.2M Na2HPO4：Na2HPO4·12H2O 71.64克，加蒸餾水至1000ml；B液: 0.2M NaH2P4：NaH2P4·2HO 3.12克，加蒸餾水至1000ml；應(yīng)用液：取A液81ml加B液19ml混合，再以生理鹽水作10倍稀釋即成。(5)0.1M, PH7.4

37、磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer PB)配制:將上述A液取81ml與B液19ml混合，再以蒸餾水對倍稀釋即成。(6)20磺基水楊酸。2.器材:普通冰箱、離心機、電磁攪拌器，751桮型紫外分光光度計、扭力天平，粗天平。透析袋、尼龍繩、細竹棒、精密PH試紙(PH5.59.0)、眼科鑷子、小剪刀。燒杯、量筒、吸管、滴管、滅菌小瓶、試管等。(三)鹽析的操作步驟取正常人混合血清加等量生理鹽水，于攪拌下逐滴加入與稀釋血清等量的飽和硫酸銨終濃度為50飽和(NH4)2SO44，3小時以上，使其充分沉淀離心(3000rpm), 20分鐘，棄上清，以生理鹽水溶解沉淀至Xml。再逐滴加飽和硫酸銨/ml

38、置4，3小時以上此時(NH4）2SO4的飽和度為33)重復(fù)上述第二步過程1?次。將末次離心后所得沉淀物以0.02M PH7.4 PBS溶解至Xml裝入透析袋。對PBS充分透析、除鹽換液3次，至萘氏試劑測透析外液為無黃色將透析袋內(nèi)樣品取少許作適當(dāng)倍數(shù)稀釋后，以751-G紫外分光光計測蛋白含量。方法如下:蛋白含量(mgml)(1.45×OD280nm-0.74×OD260nm)×樣品稀釋度。注：式中1.45與0.74為常數(shù)，nm為波長。(四)影響鹽析的因素1.蛋白質(zhì)的濃度：鹽析時，溶液中蛋白質(zhì)的濃度對沉淀有雙重影響，既可影響蛋白質(zhì)沉淀極限，又可影響蛋白質(zhì)的共沉作用。蛋

39、白質(zhì)濃度愈高，所需鹽的飽和度極限愈低，但雜蛋白的共沉作用也隨之增加，從而影響蛋白質(zhì)的純化。故常將血清以生理鹽水作對倍稀釋后再鹽析。2.離子強度:各種蛋白質(zhì)的沉淀要求不同的離子強度。例如當(dāng)硫酸銨飽和度不同，析出的成分就不同，飽和度為50時，少量白蛋白及大多數(shù)擬球蛋白析出；飽和度為33時球蛋白析出。3.鹽的性質(zhì)：最有效的鹽是多電荷陰離子。4.PH值：一般說來，蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多，它的溶解度越大。改變PH改變蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)，也就改變了蛋白質(zhì)的溶解度。5.溫度：鹽析時溫度要求并不嚴(yán)格，一般可在室溫下操作。血清蛋白于25時較0更易析出。但對溫度敏感的蛋白質(zhì)，則應(yīng)于低溫下鹽析。6.蛋白質(zhì)沉淀后宜在4放

40、3小時以上或過夜，以形成較大沉淀而易于分離。DEAE-Sephadex A-50柱層析純化免疫球蛋白撰稿歐陽笑梅原理試劑和器材操作步驟注意事項(一)原理DEAE-SephadexA-50(二乙基氨基乙基-葡聚糖A-50)為弱堿性陰離子交換劑。用NaOH將CL-型轉(zhuǎn)變?yōu)镺H-型后，可吸附酸性蛋白。血清中的球蛋白屬于中性蛋白(等電點為PH6.857.5)，其余均屬酸性蛋白。在PH7.27.4的環(huán)境中，酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50吸附，只有球蛋白不被吸附。因此，通過柱層析球蛋白便可在洗脫中先流出,而其他蛋白則被吸附在柱上,從而便可分離獲得純化的IgG。DEAE-sephadexA

41、-50柱層析是離子交換層析的一種。(二)試劑和器材1、試劑:(1)鹽析提取的人球蛋白；(2)0.5N NaOH，0.5N HCl 2M NaCl，10NaN3；(3)DEAE-Sephadex A-50，聚乙二醇(PEG)；(4)0.1M, PH7.4 PB(配制見鹽析部分)；2、器材:(1)層析玻璃柱(1.3×40cm)，滴定鐵架，自由夾，螺旋夾，尼龍紗(200目)；(2)普通冰箱，751桮型紫外分光光度計，電導(dǎo)儀、抽濾裝置(包括抽氣機、干燥瓶、布氏漏斗、橡皮墊圈、抽濾瓶)，PH計；(3)透析袋、座標(biāo)紙、濾紙、PH精密試紙；(4)量筒、燒杯、試管、吸管、滴管、滅菌小瓶等。(三) 操

42、作步驟1、DEAE-Sephadex A-50預(yù)處理稱DEAE-Sephadex A-50(下稱A-50)5克，懸于500ml蒸餾水，1小時后傾去上層細粒。按每克A-50加0.5N NaOH 15ml的比例，將A-50浸泡于0.5N NaOH中，攪勻，靜置30分鐘，裝入布氏漏斗(墊有2層濾紙)中抽濾，并反復(fù)用蒸餾水抽洗至PH呈中性；再以0.5N HCl同上操作過程處理，最后以0.5N NaOH再處理一次。處理完后，將A-50浸泡于0.1M，PH 7.4 PB中過夜。2、裝柱(1)將層析柱垂直固定于滴定鐵架上，柱底墊一園尼龍紗，出水口接一乳膠或塑料管并關(guān)閉開關(guān)。(2)將0.1M，PH7.4 PB

43、沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入經(jīng)預(yù)處理并以同上緩沖液調(diào)成稀糊狀的A-50。待A-50凝膠沉降2-3cm厚時，啟開出水口螺旋夾，控制流速1ml/分鐘，同時連續(xù)倒入糊狀A(yù)-50凝膠至所需高度。(3)關(guān)閉出水口，待A-50凝膠完全沉降后，柱面放一園形濾紙片，以橡皮塞塞緊柱上口，通過插入橡皮塞之針頭及所連接的乳膠或塑料管與洗脫液瓶相連接。3、平衡:啟開出水口螺旋夾，控制流速12-14滴/分鐘，使約2倍床體積的洗脫液流出。并以PH計與電導(dǎo)儀分別測定洗脫液及流出液之PH值與離子強度是否相同。達到一致時關(guān)閉出水口，停止平衡。4、加樣及洗脫:啟開上口橡皮塞及下口螺旋夾，使柱中液體緩慢滴出，當(dāng)柱面液體與柱

44、面相切時，立即關(guān)閉出水口，以毛細滴管沿柱壁加入樣品(體積應(yīng)<床體積的2，蛋白濃度以<100mg為宜)。松開出水口螺旋夾使柱面樣品緩慢進入柱內(nèi)，至與柱面相切時，立即關(guān)閉下口，以少量洗脫液洗柱壁2-3次；再放開出水口，使洗液進入床柱，隨后立即于柱面上加入數(shù)ml洗脫液，緊塞柱上口，使整個洗脫過程成一密閉系統(tǒng)。并控制流速1214滴分鐘。5.收集：開始洗脫的同時就以試管進行收集。每管收集35ml。共收集1015管。6.測蛋白：以751-G型紫外分光光度計分別測定每管OD280nm，與OD260nm，按前述公式計算各管蛋白含量。并以O(shè)D280nm為縱座標(biāo)，以試管編號為橫座標(biāo)，繪制洗脫曲線。7.

45、合并、濃縮：將洗脫峰的上坡段與下坡段各管收集液分別進行合并，以PEG(MW6000)洗縮至所需體積，加入0.02NaN防腐劑，于4保存?zhèn)溆谩?.A-50凝膠的再生:在柱上先以2M NaCl洗柱上的雜蛋白至流出液的OD280nm<0.02，再以蒸餾水洗去柱中鹽。然后按預(yù)處理過程將A-50再處理一遍即達再生。近期用時泡于洗脫緩沖液中保存；近期不用時，以無水酒精洗2次，再置50溫箱烘干，裝瓶內(nèi)保存。(四)注意事項1.柱的選擇：從理論上說，只要柱足夠長，就得獲得理想的分辨率，但由于層析柱流速同壓力梯度有關(guān)，柱長增加使流速減慢，峰變寬，分辨率降低。柱的直徑增加，使液體流動的不均勻性增加，分辨率明顯

46、下降。2.純化過程必須嚴(yán)格控制脫緩沖液的PH及離子強度。樣品與A-50凝膠必須用洗脫緩沖液徹底平衡后，才能進行柱層析。3.所裝的柱床必須表面平整，無溝流及氣泡，否則應(yīng)重裝。4.洗脫過程中應(yīng)嚴(yán)格控制流速，且勿過快。5.上樣的體積要小，濃度不宜過高。6.加樣及整個洗脫過程中，嚴(yán)防柱面變干。Sepharose CL-4B親和柱層析純化IgG及IgG亞類撰稿金伯泉歐陽笑梅原理操作步驟試劑器材注意事項 (一)原理葡萄球菌A蛋白(SPA)具有與多種哺乳動物IgG分子Fc段結(jié)合的能力，并與不同IgG亞類的結(jié)合力有所差別。利用改變PH及離子強度可洗脫結(jié)合于SPA-Sepharose CL-4B柱上的

47、IgG或不同的IgG亞類，可直接純化血清或小鼠腹水中的IgG抗體。(二)操作步驟用0.1M PH8.0 磷酸緩沖液浸泡SPA-Sepharose CL-4B凝膠，15min。按1g干膠200ml上述緩沖液充分洗滌凝膠(用玻璃漏斗過濾或置燒杯中洗滌)裝柱后用0.1M PH8.0磷酸緩沖液平衡標(biāo)本可用硫酸銨粗提物，先10,000g離心除去雜質(zhì)，必要時用0.22m濾膜過濾。上樣前用1M PH9.0 Tris液調(diào)整標(biāo)本液PH至8.1或?qū)ζ胶庖和肝鲞^夜加樣，一般按2530mgIgGg濕膠比例加樣，室溫作用15min,0.1M PH8.0磷酸緩沖液充分淋洗至淋洗液OD值為<0.02。用不同PH的枸椽

48、酸洗脫液洗脫，流速20mlh。如純化小鼠IgG1一般用PH6.0；純化IgG2a用PH4.0；純化IgG2b用0.1M PH3.0醋酸鹽緩沖液或0.1M PH3.0 Glycine-HCl緩沖液洗脫。用PH3.0或4.0洗脫液洗脫時，用適量固體Tris直接中和含有IgG的洗脫液收集洗脫液測OD值，根據(jù)實驗需要透析除鹽后進行濃度、純度和活性測定(三)試劑器材1.SPA-Sepharose CL-4B(pharmacia)2.磷酸緩沖液0.1M PH8.00.02 NaN3.枸椽酸緩沖液0.1M PH6.00.1M PH4.00.02 NaN30.1M PH3.04.1M PH9.0 Tris溶液

49、5.再生緩沖液(1) 0.1M Tris含0.5M NaCl調(diào)正PH至8.50.02NaN3；(2) 0.1M醋酸鈉含0.5M NaCl調(diào)正PH至4.50.02NaN3。6.110ml柱體積的玻璃柱或塑料柱(四)注意事項1.SPA-Sepharose CL-4B凝膠價格昂貴，可再生后反復(fù)使用1020次左右。方法:先用10倍柱體積0.1M PH8.5 Tris含0.5M NaCl溶液洗脫柱上的殘存雜蛋白；再用10倍柱體積0.1M PH4.5醋酸鈉緩沖液含0.5M NaCl液洗脫柱上殘存的雜蛋白；0.1M PH8.0磷酸緩沖液平衡，4貯存。2.SPA-Sepharose CL-4B親和層析法還可用

50、于:(1)除去抗體液中IgG，檢測非IgG抗體(如IgM)的生物學(xué)活性；(2)除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段； (3)回收或純化免疫復(fù)合物。3.、狗、貓的多克隆IgM和IgA以及單克隆IgA和IgM也具有與SPA結(jié)合的能力。高效液相色譜純化小鼠腹水中單克隆抗體撰稿金伯泉從小鼠腹水中純化McAb的方法有鹽析、離子交換層析、凝膠過濾和親和層析等。應(yīng)用TSKDEAE-SPW離子交換層析柱從小鼠腹水中純化McAb不僅純化速度快，回收率和得率高，而且保持良好的生物學(xué)活性。原理操作步驟試劑和器材注意事項(一)原理根據(jù)離子交換原理，將經(jīng)硫酸銨粗提的含McAb球蛋白上樣結(jié)合于層析柱上，通過增加洗

51、脫液中的離子強度，洗脫并收集蛋白峰。(二)操作步驟腹水10,000g離心10min，除去細胞和雜質(zhì)，在4條件下逐滴加入飽和硫酸銨溶液，使終濃度為40飽和硫酸銨攪拌2030min離心，沉淀用40飽和硫酸銨洗滌2次后溶于PBS，對緩沖液A(PH8.5 20mM Tris緩沖液)透析除鹽4過夜用帶有1000l樣品環(huán)的高壓加樣活門將透析后粗提物加樣于經(jīng)緩沖液A液平衡的TSK DEAE SPW離子交換層析柱洗脫流速1mlmin01min：05緩沖液B(20mM Tris, PH8.5, 含2.0M醋酸鈉)120min(線性梯度洗脫)：520緩沖液B2022min：200緩沖液B洗脫液用紫外280nm進行監(jiān)測收集蛋白峰，進行含量、純度和活性測定(三)試劑和器材1. TSK DEAE SPW離子交換層析柱(75×7.5mm, Bio Rad)2.高效液相色譜儀(包括控制系統(tǒng)、溶劑傳遞系統(tǒng)、高壓加壓活門和紫外280nm監(jiān)測系統(tǒng))。3.PBS，緩沖液A和B(四)注意事項1.所用緩沖液和加樣粗提物均需0.22m濾膜過濾。2.在本實驗條件下，IgG1峰一般在線性梯度洗脫開始1112min。但不同類和亞類抗體以及不同特異性McAb的存留時間(retention time)有所差異。單克隆抗體(McAb)親和層析柱純化重組人2a干擾素(rHuIFN-2a)