人不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)酶聯(lián)免疫分析試劑盒

1、人不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說(shuō)明書(shū)產(chǎn)品編號(hào)：E0491hUSCNLIFE TMn 本試劑盒僅供體外研究使用!預(yù)期應(yīng)用ELISA法定量測(cè)定人血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)含量。實(shí)驗(yàn)原理用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗LTB抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗LTB抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的LTB呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。 試劑盒組成及試劑

2、配制 1. 酶聯(lián)板：一塊（96孔） 2. 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 ng/ml，做系列倍比稀釋(注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋)后，分別稀釋成200 ng/ml，100 ng/ml，50 ng/ml，25 ng/ml，12.5 ng/ml，6.25 ng/ml，3.12 ng/ml，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制。如配制100 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml (不要少于0.5ml ) 200 ng/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻

3、即可，其余濃度以此類(lèi)推。3. 樣品稀釋液：1×20ml。4. 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。5. 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。6. 檢測(cè)溶液A：1×120l（1:100）臨用前以檢測(cè)稀釋液A 1:100稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（100l/孔），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制。如10l檢測(cè)溶液A加990l檢測(cè)稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。7. 檢測(cè)溶液B：1×120l/瓶（1:100）臨用前以檢測(cè)稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測(cè)溶液A。8. 底物溶液：1×10ml/瓶。 9. 濃洗滌液：1

4、15;30ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 10. 終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 11. 覆膜：5張12. 使用說(shuō)明書(shū)：1份自備物品 1. 酶標(biāo)儀（建議參考儀器使用說(shuō)明提前預(yù)熱） 2. 微量加液器及吸頭，EP管3. 蒸餾水或去離子水，全新濾紙 標(biāo)本的采集及保存 1. 血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4過(guò)夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20或-80保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20或-80保存，但

5、應(yīng)避免反復(fù)凍融。3. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請(qǐng)1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20或-80保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。注：以上標(biāo)本置4保存應(yīng)小于1周，-20或-80均應(yīng)密封保存，-20不應(yīng)超過(guò)1個(gè)月，-80不應(yīng)超過(guò)2個(gè)月；標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。樣本處理：血清或血漿標(biāo)本推薦稀釋100倍，如：稀釋100倍，取10uL血清或血漿加入990uLPBS。標(biāo)本使用0.1 M 的PBS稀釋（PH=7.0-7.2）。建議各實(shí)驗(yàn)室在操作前先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以建立最佳稀釋倍數(shù)。操作步驟實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫（試劑不能直接在37溶解）；試劑或樣

6、品稀釋時(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測(cè)樣品含量，如樣品濃度過(guò)高時(shí)，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測(cè)范圍，計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00l，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100l，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37反應(yīng)120分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測(cè)溶液A工作液 100l（在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），酶標(biāo)板加上覆膜, 37反應(yīng)60分鐘。3. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體

7、，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400l/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。 4. 每孔加檢測(cè)溶液B工作液（同檢測(cè)A工作液） 100l，酶標(biāo)板加上覆膜37反應(yīng)60分鐘。5. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350l/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。6. 依序每孔加底物溶液90l，酶標(biāo)板加上覆膜37避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。7. 依序每孔加終止溶液50l，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間

8、到后應(yīng)盡快加入終止液。8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后立即進(jìn)行檢測(cè)。注：1. 試劑準(zhǔn)備：所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫，使用后請(qǐng)立即按照說(shuō)明書(shū)要求保存試劑。 實(shí)驗(yàn)操作中請(qǐng)使用一次性的吸頭，避免交叉污染。2. 加樣：加樣或加試劑時(shí)，請(qǐng)注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品，酶結(jié)合物或底物時(shí)，第一個(gè)孔與最后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大，將會(huì)導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育”時(shí)間，從而明顯地影響到測(cè)量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。一次加樣時(shí)間（包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品）最好控制在10分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用多道移液器加樣。3. 孵育：為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒

9、內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài);同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的孵育時(shí)間和溫度。4. 洗滌：洗滌過(guò)程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響最后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。5. 試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請(qǐng)手甩幾下或少時(shí)離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A工作液、檢測(cè)溶液B工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請(qǐng)精確配置標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡量不要微量配置（如吸取檢測(cè)溶液A時(shí)，一次不要小于10l

10、），以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成的濃度誤差；請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A工作液或檢測(cè)溶液B工作液。6. 反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘），如顏色較深，請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過(guò)強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。7. 底物：底物請(qǐng)避光保存，在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。 建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。 如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)最后乘以稀釋倍數(shù)。洗板方法1. 手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少注入孔內(nèi)

11、，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復(fù)此過(guò)程數(shù)次。2. 自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中。特異性 本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的人LTB，且與其它相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。計(jì)算 以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為縱坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），OD值為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），在對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析，如，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。 檢測(cè)范圍：3.12 ng/ml - 200 ng/ml最低檢測(cè)限：0.78 ng/mL說(shuō)明 1. 只有全部使用USCNLIFETM試劑才能保證檢測(cè)效果，因?yàn)樗性噭┒际怯嘘P(guān)聯(lián)的，不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴(yán)格遵守USCNLIFETM試劑的試驗(yàn)說(shuō)明才會(huì)得到最佳的檢測(cè)結(jié)果。2. 在儲(chǔ)存及孵育過(guò)程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染，試劑避免受到微生物的污染，因?yàn)榈鞍姿饷傅母蓴_將導(dǎo)致出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。3. 試劑盒保