滅蚊真菌貴陽腐霉基因組文庫的構(gòu)建

1、    【摘要】  目的： 建立貴陽腐霉（Pythium guiyangense Su）基因組文庫以便克隆該真菌的基因特別是與滅蚊毒力有關(guān)的基因。方法: 用限制性內(nèi)切酶Sau3AI消化貴陽腐霉基因組DNA，同時用限制性內(nèi)切酶BamHI消化質(zhì)粒pBluescript SK(-)，再將其去磷酸化；將基因組的酶切產(chǎn)物連接到載體上，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5。 結(jié)果: 所建貴陽腐霉的基因組文庫共包含11 520個克隆。經(jīng)藍白斑篩選、PCR驗證以及雙酶切驗證，文庫平均插入片段長度為1.2 kb，覆蓋率約為貴陽腐霉基因組的3倍。結(jié)論: 建立了貴陽腐霉的

2、基因組文庫，可以從中克隆與貴陽腐霉滅蚊毒力有關(guān)的基因。 【關(guān)鍵詞】  真菌； 滅蚊； DNA限制酶類； 貴陽腐霉； 基因組文庫    Abstract Objective: To construct a genomic library of Pythium guiyangense Su, strain 1938 GY.  Methods: The digested genomic DNA with Sau3AI was inserted into pBluescript SK(-) plasmid which was digested

3、 with BamHI and treated with calf intestinal alkaline phosphatase . Next, the recombinant plasmids were transferred into E.coli DH5. Results: A genomic DNA library was constructed which included 11520 clones with average insert sizes about 1.2 kb. Conlusions: The results of this experiment provide a

4、 source for screening genes of P.guiyangense ,and lay basis for further work of genetic engineering of this fungus.    Key words fungi; mosquito control; DNA restriction enzymes; Pythium guiyangense Su; genomic DNA library    貴陽腐霉（Pythium guiyangense Su）是蘇曉慶教授于1994年在貴陽醫(yī)學院土壤中分離得到的

5、一株新的滅蚊真菌，屬卵菌綱、霜霉目、腐霉科、腐霉屬。實驗證明，幾丁質(zhì)酶在真菌侵染昆蟲的過程中發(fā)揮著十分重要的作用1，2。2003-2005年，對幾丁質(zhì)類似物誘導后的貴陽腐霉懸液中的胞外蛋白酶進行檢測，成功地檢測到幾丁質(zhì)酶活性，并初步克隆了疑似該酶基因的DNA片段。為了在此片段的基礎(chǔ)上獲得貴陽腐霉幾丁質(zhì)酶的全長基因以及其他與滅蚊毒力有關(guān)的基因，以便用于貴陽腐霉的基因工程改良，因此，構(gòu)建了貴陽腐霉的基因組文庫。現(xiàn)報道如下。    1  材料與方法    1.1  材料     1

6、.1.1  菌種與質(zhì)粒  真菌：貴陽腐霉（strain GY 1938）是1994年在貴陽醫(yī)學院土壤中分離的高效滅蚊真菌，經(jīng)純化接種于SFE和KPYG2瓊脂平板上，常規(guī)保種、傳代，培養(yǎng)溫度為（25±1）。    大腸桿菌E.coli DH5由本實驗室保存于-70 。質(zhì)粒pBluescript SK(-)是一種Cloning vector，具有氨芐青霉素抗性, 購自上海生工公司。    1.1.2  試劑  限制性內(nèi)切酶BamHI、Sau3AI、氨芐青霉素（Ampic

7、illin）、T4DNA連接酶為TAKARA公司產(chǎn)品，Taq DNA聚合酶、dNTP、溴化乙錠（EB）為SABC公司產(chǎn)品，RNA酶、牛小腸堿性磷酸酶（CIAP）、X-gal及異丙基-D-硫代半乳糖苷酶（IPTG）為Promega公司產(chǎn)品，其余均為進口或國產(chǎn)分析純試劑。    1.1.3  培養(yǎng)基  KPYG2培養(yǎng)基：蛋白胨1.5 g/L, 酵母浸出膏0.5 g/L, 葡萄糖3.0 g/L, 膽固醇25 mg/L, 氯化鈣110 mg/L, 玉米油10 g/L3。SFE培養(yǎng)基 ：將100 g葵花子粉碎，浸泡于1 000 ml蒸餾水中，6

8、層紗布過濾，再加1 000 ml蒸餾水，分裝貯存于-20 ，臨用時取出解凍，用蒸餾水稀釋1倍，高壓蒸汽滅菌30 min3。LB培養(yǎng)基 ：蛋白胨10 g/L, 酵母浸出膏5 g/L, 氯化鈉10 g/L (pH7.0)4。基因組文庫保存培養(yǎng)基5：1/10保存液1（K2HPO4360 mol/L、KH2PO4132 mol/L、C6H8O7·H2O17 mol/L、Glycerol 44%）, 1/100保存液2(MgSO444 mol/L 、(NH4)2SO4 680 mol/L )，50 mg/L Amp，液體LB培養(yǎng)基補足100 ml。    1.2 

9、 方法    1.2.1  基因組DNA的提取  采用氯化芐法提取貴陽腐霉基因組DNA，將菌絲研磨后加氯化芐等不斷混勻，經(jīng)離心、抽提及RNA酶消化，置-20 備用。用紫外分光光度計測定基因組DNA濃度，并用瓊脂糖凝膠電泳測定其純度6。    1.2.2  貴陽腐霉基因組DNA的純化  采用北京華美生物公司的DNA純化試劑盒進行純化，按其說明書操作步驟進行。    1.2.3  貴陽腐霉基因組DNA的部分酶切及目的片段的回收&#

10、160; 用限制性內(nèi)切酶Sau3AI消化貴陽腐霉基因組DNA產(chǎn)生5-GATC突出末端，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化后-20 保存?zhèn)溆?。    1.2.4  質(zhì)粒pBluescript SK(-)的提取、限制性內(nèi)切酶酶切和去磷酸化  用質(zhì)粒小量制備試劑盒抽提質(zhì)粒pBluescript SK(-)，將其用限制性內(nèi)切酶BamHI進行消化，產(chǎn)生5-GATC突出末端，用CIAP使消化后的質(zhì)粒DNA脫磷酸化，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化后-20 保存?zhèn)溆?。    1.2.5  構(gòu)建文庫&#

11、160; 將處理后的DNA片段與載體連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌進行藍白斑初篩。    1.2.6  文庫質(zhì)量的檢測及保存  對可能的陽性克隆進行PCR驗證及雙酶切驗證，最后保存在加有基因組文庫保存液的96孔細胞培養(yǎng)板中。   2  結(jié)果    2.1  貴陽腐霉基因組DNA的部分酶切    用限制性內(nèi)切酶Sau 3AI 在37 作用5 min部分酶切基因組DNA，大部分酶切產(chǎn)物集中在5003 000 bp。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢

12、測結(jié)果見圖1。    2.2  質(zhì)粒pBluescript SK(-)的酶切和去磷酸化    用限制性內(nèi)切酶BamHI消化pBluescript SK(-)質(zhì)粒DNA，然后用CIAP進行處理，產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測（見圖2）。2.3  文庫的構(gòu)建、檢測及保存    經(jīng)過連接、轉(zhuǎn)化等過程將文庫構(gòu)建好后，保存在4塊96孔板中，每孔30個菌落，克隆數(shù)達到約11 520個克隆。經(jīng)過陽性克隆的PCR驗證及雙酶切驗證，擴增產(chǎn)物為5002 500 bp，集中于1 0001 500 bp。為了確定文庫

13、中插入片段大小的分布情況，將隨機挑取的30個克隆按插入片段大小進行分組（如圖3），從圖中可以看出：該文庫插入片段大小分布在5002 500 bp，平均長度為1 200 bp。3  討論    為了獲得已知片段的旁側(cè)序列，構(gòu)建一個基因組文庫，然后利用已知序列從中篩選出完整的基因序列是一種較為常用的方法。也就是說，我們可以在所建立的貴陽腐霉基因組文庫的基礎(chǔ)上，根據(jù)已知片段篩選出其幾丁質(zhì)酶基因的全長。另外，基因組文庫還可用于大規(guī)?；蚪M測序、物理圖譜的構(gòu)建及制作基因組芯片等。因此，構(gòu)建一個基因組文庫對多項研究都有著十分重要的意義。    由

14、完全隨機片段組成的基因組文庫的大小，必須保證能夠足以代表基因組中任何一個特定基因序列，它取決于克隆片段的大小和基因組的大小。要以概率P從文庫中分離出某一特定序列所必須篩選的克隆數(shù)N，可通過函數(shù)式表示：    N=ln( 1-P )/ln( 1-f)    其中，N為所需重組質(zhì)粒數(shù)，P為任何一段DNA序列出現(xiàn)的概率，f為插入片段的平均長度與基因組總長度之比7，8。    貴陽腐霉基因組的大小尚未確定，但腐霉基因組的大小平均在1 000 kb。本實驗中插入片段平均長度在1.2 kb左右。因此，要以99的概率（P ）篩選到基因組任意一個基因

15、，則需要重組質(zhì)粒數(shù)（N）為3 838。一般來說，為了以較大的幾率篩選出目的基因，一個基因組文庫必須含有310倍于最低重組體克隆數(shù)的克隆。本研究所構(gòu)建文庫的覆蓋倍數(shù)約為3倍，基本達到構(gòu)建基因組文庫的要求。當然，如果覆蓋倍數(shù)能夠達到10倍，從理論上來說，可以提高篩選出目的片段的可能性。    可以在下一步的工作中用獲得的疑似貴陽腐霉幾丁質(zhì)酶基因的片段在目前所建立的基因組文庫中去篩選出其完整的基因序列，并進行表達驗證。同時，本文庫為進一步克隆貴陽腐霉的其他與滅蚊毒力有關(guān)的基因創(chuàng)造了條件，而這些基因?qū)τ谫F陽腐霉的基因工程改良具有重要價值?！緟⒖嘉墨I】  1 陳紅

16、，李平,鄭愛萍，等.廣譜抗病蟲幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌X2-23的篩選與鑒定J.植物病理學報，2003（4）：368-372.2 Weiguo Fang, Bo Leng, Yuehua Xiao, et al .Cloning of Beauveria bassiana chitinase gene Bbchit1 and its application to improve fungal strain virulenceJ. Applied and environmental microbiology,2005(1):363-370.3 YU Sheng, DUAN Si-liang, SU Xiao-qing.Purification and characterization of a subtilisin-like protease (Pr1) of Pythium guiyangenseJ.貴陽醫(yī)學院學報，2007(2):126-130.4 薩姆布魯克，D.W.拉塞爾.分子克隆實驗指南M.北京：科學出版社，2003：1595-1597.5 劉紅美.新型可轉(zhuǎn)化人工染色體及水稻基因組文庫的構(gòu)建D.廣州：華南農(nóng)業(yè)大學,2001.6 Zhu Heng,