化痰活血軟堅(jiān)法對(duì)腎小球硬化大鼠腎組織MMP2、TIMP2的影響

1、化痰活血軟堅(jiān)法對(duì)腎小球硬化大鼠腎組織MMP-2、TIMP-2 的影響【摘要】目的探討化痰活血軟堅(jiān)法防治腎小球硬化的作用機(jī)制。方法以化痰活血軟堅(jiān)方對(duì)腎小球硬化大鼠進(jìn)行干預(yù)，用SABC法和原 位雜交法檢測大鼠腎組織MMP-2. TIMP-2. TIMP-2 raRNA的表達(dá)，運(yùn)用 圖像分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量分析。結(jié)果化痰活血軟堅(jiān)方對(duì)模型 大鼠腎組織MMP-2. TIMP-2. TIMP-2 mRNA的表達(dá)均有顯著促進(jìn)作用, 且使顯著下降的 W-2/TIMP-2比值明顯回升。結(jié)論化痰活血軟堅(jiān)法 調(diào)整MMP-2與TIMP-2之間的動(dòng)態(tài)平衡是其防治腎小球硬化的重要機(jī) 制?！娟P(guān)鍵詞】 化痰活血軟堅(jiān)法；腎

2、小球硬化；MMP-2； TIMP-2基質(zhì)金屬蛋口酶系統(tǒng)（MMPs）是促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）降解的主要酶系，與腎小球硬化密切相關(guān)?；祷钛泩?jiān)法是根據(jù)腎小球硬 化的病理特點(diǎn)、發(fā)生機(jī)制以及中醫(yī)對(duì)其病 因病機(jī)的認(rèn)識(shí)并結(jié)合中西醫(yī) 藥防治腎小球硬化的經(jīng)驗(yàn)而確立的治療方法，依據(jù)治法筆者自擬處方 進(jìn)行了初步實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果顯示對(duì)腎小球硬化有很好的防治作用。為 探討該法的作用機(jī)理，對(duì)其影響腎小球硬化模型大鼠腎組織MMP-2及 其抑制物TIMP-2表達(dá)的作用進(jìn)行了觀察。現(xiàn)報(bào)告如下。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料 k 1. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠，雄性，體重180-200 g 山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：

3、SCXK （魯）20030004o1.1.2藥物與試劑 化痰活血軟堅(jiān)方由海藻.丹參、大黃、黃罠.當(dāng)歸組成。水煎兩次，大黃后入，濾取藥液合并，減壓濃縮（800 為0. 4g/mb低溫保存?zhèn)溆?。使用前放至室溫并搖勻。親和純化兔抗MMP-2多克隆抗體、親和純化兔抗TIMP-2多克隆抗體、生物素化山羊 抗兔IgG、SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、TIMP-2 mRXA原位 雜交試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。鹽酸多柔比星深圳萬 樂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào):0103El,使用時(shí)以生 理鹽水稀釋成Im g/m 1的溶液。1.2實(shí)驗(yàn)方法1. 2. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組將大鼠隨機(jī)分為正常組10只.模型

4、組15只、中藥組15只，自由飲水進(jìn)食，1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1. 2. 2模型制備 大鼠稱重，腹腔注射0. 2ral /lOOg體重1. 75%戊巴比妥鈉生理鹽水溶液麻醉。從背部摘除左腎，縫合傷口。正常組行假手術(shù)，不摘除腎臟，余與上同。手術(shù)1周后，大鼠第一次尾靜脈 注射阿霉素5mg/kg體重，手術(shù)5周后第二次注射阿霉素3ing/kg體重。正常組尾靜脈注射等量生理鹽水。1.2.3給藥 第一次注射阿霉素1周后，中藥組灌胃給藥Iml/lOOg體重，正常組和模型組給了等量蒸鐳水。連續(xù)給藥12周。實(shí)驗(yàn)過程中模型組6只死亡，中藥組死亡4只。1. 2. 4標(biāo)本的收集與處理 摘取右腎，迅速冠狀切開，分別以10%甲醛

5、和4%多聚甲醛（DEPC水配制）固定，石蠟包埋。甲醛固定組織切 片厚度4unb多聚甲醛固定的組織切片厚度6umo1.2.5腎組織MMP-2. TIMP-2免疫組化檢測 采用SABC法檢測,兔抗大鼠MMP-2抗體和兔抗大鼠TIMP-2抗體1:100倍稀釋，PBS代替 一抗作為陰性對(duì)照。OLYMPUS BX41光學(xué)顯微鏡觀察，每張切片任選10 個(gè)腎小球，OLYMPUS C-4000Z00M數(shù)碼相機(jī)照相（光亮度設(shè)定一致）, 用Image-pro plus 4. 5圖像分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量分析9每張切 片隨機(jī)選取10個(gè)視野，測定10個(gè)視野的積分光密度，以均值作為該 樣木MMP-2、TIMP-2的相

6、對(duì)表達(dá)量。1. 2. 6腎組織TIMP-2 mRXA檢測 采用原位雜交法。結(jié)果分析同上。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)以SPSS11. 0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果模型大鼠腎組織MMP-2. TIMP-2> TIMP-2 mRA表達(dá)均減弱，且MMP-2/TIMP-2比值下降，差異有顯著性（P<0.01）o化痰活血軟堅(jiān) 方干預(yù)后模型大鼠腎組織MMP-2. TIMP-2s TIMP-2 mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0. ODo 從 MMP-2 與 TIMP-2 的比值看，模型大鼠 MMP-2/TIMP-2 數(shù)值下降顯

7、著（PV0.01）,化痰活血軟堅(jiān)方使二者比值明顯回升（P <0. ODo結(jié)果見表1、表2。表1對(duì)腎組織MMP-2. TIMP-2的影響： 與模型組比較，探PV0.01表2腎組織TIMP-2 mRXA的表達(dá) 注：與模 型組比較，探P<0. 013討論基質(zhì)金屬蛋口酶家族（MMPs）是一組可降解ECM的酶，是腎臟內(nèi)主要的基質(zhì)降解酶體系，其表達(dá)量及活性的高低直接影響著腎小球ECM的表達(dá)量和在局部的沉積。研究事實(shí)證明，MMPs活性下降是導(dǎo)致ECM成分在腎小球內(nèi)不斷積聚，從而導(dǎo)致腎小球硬化的重要機(jī)制之一。MMP-2屬i- MMPs家族的明膠酶類，能降解IV、V、Vn、X型膠原。現(xiàn)已證實(shí)腎小球系

8、膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、包曼氏囊壁層 上皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、浸潤的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等能不同 程度地表達(dá)W-2o生理狀態(tài)下，MMP-2和其抑制物TIMP-2處于相對(duì) 平衡狀態(tài)，使有活性的MMP-2控制在一定范圍內(nèi)，從而使ECM的降解 與合成也達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，這對(duì)于維持腎小球?yàn)V過膜的完整具有重要意 義。病理狀態(tài)下，MMP-2減少或TIMP-2增多，二者比例失衡，即可導(dǎo) 致ECM的降解減少，進(jìn)行性積聚。研究證明，MMP-2異常表達(dá)與腎小 球炎性病變過程中ECM結(jié)構(gòu)和功能的改變以及腎臟系膜區(qū)內(nèi)細(xì)胞外基 質(zhì)蛋口的沉積等有密切關(guān)系叮。體外研究發(fā)現(xiàn)，人腎小球系膜細(xì)胞 在含糖基化IV型膠原的培養(yǎng)基中

9、培養(yǎng)37天，與正常培養(yǎng)基相比，系 膜細(xì)胞表達(dá)IV型膠原增加25%200%, MMP-2減少20%50%，將系膜 細(xì)胞置于含25mmol/L的高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，也得到了類似的結(jié)果2。有人報(bào)告糖尿病腎病腎小球硬化與MMP-2密切相關(guān)，在16例NIDDM 患者的腎活檢標(biāo)木中用RT PCR的方法均未檢測到MMP-2基因表達(dá)，而 其他作為對(duì)照組的10例活檢標(biāo)本均見表達(dá)3。另有研究顯示MMP-2 過度分泌，ECM過度降解，會(huì)造成腎小球?yàn)V過膜的損傷4。因此, 維持MMP-2及其抑制物的動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)于保持腎小球結(jié)構(gòu)完整和正常 功能至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示，模型大鼠腎組織MMP-2 . TIMP-2及MMP-2

10、/TIMP-2比值顯著下降，藥物干預(yù)可促進(jìn)它們的表達(dá),MMP-2/TIMP-2比值明顯升高，說明調(diào)整MMP-2與TIMP-2之間的動(dòng)態(tài) 平衡是藥物發(fā)揮效應(yīng)的途徑之一。另外，藥物對(duì)TIMP-2與TIMP-2 mRNA 的影響一致，提示化痰活血軟堅(jiān)法影響TIMP-2的分泌可能通過調(diào)控TIMP-2 mRNA的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Baricos WH, Cortez SL, El Dahr SS, et ak ECM degradationby cultured humanraan mesangial cell sisraediated by aPA/p1asraid/MMP2 cascade.Kidney Int,1995,47:1037.2 Anderson SS, Wu K, Nagase tb et al. Effect of matrix glycation on expression of type IVcollagen, MMP2, MMP9 and TIMPl by human massangial cells. Cell dhes Commun 1996, 4(2) :89-101.3 DelPrete D.