大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)及發(fā)酵技術(shù)ppt課件

1、 動物細(xì)胞的特點(diǎn)：動物細(xì)胞的特點(diǎn)： 無細(xì)胞壁無細(xì)胞壁 倍增時間長，生長緩慢倍增時間長，生長緩慢 需氧量少，對攪拌敏感需氧量少，對攪拌敏感 聚集體構(gòu)成聚集體構(gòu)成 原代細(xì)胞培育原代細(xì)胞培育50代即開場退化代即開場退化 動物細(xì)胞培育的定義：動物細(xì)胞與動物細(xì)胞培育的定義：動物細(xì)胞與組織培育是從動物體內(nèi)取出細(xì)胞或組織培育是從動物體內(nèi)取出細(xì)胞或組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無菌、適溫暖豐富的營養(yǎng)條件下，使菌、適溫暖豐富的營養(yǎng)條件下，使離體細(xì)胞或者組織生存、生長并維離體細(xì)胞或者組織生存、生長并維持構(gòu)造和功能的一門技術(shù)持構(gòu)造和功能的一門技術(shù) 生長特性生長特性 貼壁生長型：如人胚肺細(xì)

2、胞，貼壁生長型：如人胚肺細(xì)胞，Hela細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞 懸浮生長型：如血液白細(xì)胞、淋巴懸浮生長型：如血液白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等細(xì)胞等 體外培育特點(diǎn)體外培育特點(diǎn) 體外培育工具體外培育工具 體外培育條件體外培育條件 體外細(xì)胞生長增殖過程體外細(xì)胞生長增殖過程 培育方法培育方法 大規(guī)模培育技術(shù)大規(guī)模培育技術(shù) 營養(yǎng)條件苛刻營養(yǎng)條件苛刻 順應(yīng)性差，敏感順應(yīng)性差，敏感 培育時間長，易污染培育時間長，易污染 溫度，溫度，37 pH：7.2-7.4 氣體：氧，二氧化碳，氮?dú)鈿怏w：氧，二氧化碳，氮?dú)?營養(yǎng)條件：需求多種氨基酸，維生素，營養(yǎng)條件：需求多種氨基酸，維生素，輔酶，核酸，嘌呤，

3、嘧啶，激素和生長輔酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生長因子，其中多種成分可由血清提供因子，其中多種成分可由血清提供 反響器貼壁培育反響器貼壁培育 容易換液，不需特殊的分別細(xì)胞和培育容易換液，不需特殊的分別細(xì)胞和培育液的設(shè)備，可采用灌流培育獲得高密度液的設(shè)備，可采用灌流培育獲得高密度，但擴(kuò)展規(guī)模較難，適宜制備量小，價，但擴(kuò)展規(guī)模較難，適宜制備量小，價值高的生物藥品。值高的生物藥品。CelliGen PlusTM 微載體培育微載體培育 最有出路的動物細(xì)胞大規(guī)模培育技術(shù)，最有出路的動物細(xì)胞大規(guī)模培育技術(shù)，兼有懸浮培育和貼壁培育的優(yōu)點(diǎn)，易于兼有懸浮培育和貼壁培育的優(yōu)點(diǎn)，易于放大。放大。Cytodex，Cy

4、topore和和Cytoline 無血清懸浮培育無血清懸浮培育 用知人源或動物來源的蛋白或激素替代用知人源或動物來源的蛋白或激素替代動物血清的一種細(xì)胞培育技術(shù)動物血清的一種細(xì)胞培育技術(shù) pH 溶氧溶氧 溫度溫度 谷氨酸谷氨酸/谷氨酰胺谷氨酰胺 葡萄糖葡萄糖 乳酸乳酸 CO2 NH4+ K+/Na+ Ca+ 浸透壓浸透壓 細(xì)胞密度細(xì)胞密度 細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡 細(xì)胞在高密度條件下，由于細(xì)胞的細(xì)胞在高密度條件下，由于細(xì)胞的多層生長，存在細(xì)胞接觸抑制效應(yīng)多層生長，存在細(xì)胞接觸抑制效應(yīng)，細(xì)胞的生長和表達(dá)均遭到嚴(yán)重影，細(xì)胞的生長和表達(dá)均遭到嚴(yán)重影響響 細(xì)胞凋亡主要是細(xì)胞生長的條件較惡劣細(xì)胞凋亡主要是細(xì)胞生長

5、的條件較惡劣，包括：，包括： 1.營養(yǎng)缺乏營養(yǎng)缺乏 2.有害代謝產(chǎn)物的積累有害代謝產(chǎn)物的積累 3.pH和溶氧控制不當(dāng)和溶氧控制不當(dāng) 4.機(jī)械攪拌剪切力較大機(jī)械攪拌剪切力較大 5.浸透壓浸透壓 消費(fèi)疫苗消費(fèi)疫苗 蛋白質(zhì)和多肽藥物蛋白質(zhì)和多肽藥物 基因治療基因治療 單抗單抗概述概述傳統(tǒng)：釀酒、抗生素、制醋傳統(tǒng)：釀酒、抗生素、制醋基因工程：消費(fèi)蛋白質(zhì)藥物、疫苗等基因工程：消費(fèi)蛋白質(zhì)藥物、疫苗等大腸桿菌、酵母大腸桿菌、酵母普通采用高密度發(fā)酵技術(shù)普通采用高密度發(fā)酵技術(shù)培育過程決議于：培育過程決議于：菌種菌種培育條件培育條件微生物培育過程重要參數(shù)：微生物培育過程重要參數(shù)：溫度溫度pH溶氧溶氧葡萄糖葡萄糖/

6、甘油甘油乙酸乙酸 乳酸乳酸 NH4+ 磷酸鹽磷酸鹽 乙醇乙醇(酵母酵母) 甲醇甲醇(酵母酵母) 細(xì)胞密度細(xì)胞密度發(fā)酵培育基發(fā)酵培育基表達(dá)基因的調(diào)控表達(dá)基因的調(diào)控宿主菌宿主菌質(zhì)粒的拷貝數(shù)及穩(wěn)定性質(zhì)粒的拷貝數(shù)及穩(wěn)定性高密度培育的關(guān)鍵是發(fā)酵的補(bǔ)料控制高密度培育的關(guān)鍵是發(fā)酵的補(bǔ)料控制,根據(jù)根據(jù)重組菌的生長特點(diǎn)及產(chǎn)物的表達(dá)方式采重組菌的生長特點(diǎn)及產(chǎn)物的表達(dá)方式采取合理的營養(yǎng)物質(zhì)的流加方式取合理的營養(yǎng)物質(zhì)的流加方式恒速流加恒速流加變速流加變速流加指數(shù)流加指數(shù)流加微生物高密度培育乙酸的構(gòu)成微生物高密度培育乙酸的構(gòu)成:培育液中葡培育液中葡萄糖的含量超越菌體生長所需量或在缺氧萄糖的含量超越菌體生長所需量或在缺氧

7、的情況下的情況下,便會大量產(chǎn)生乙酸便會大量產(chǎn)生乙酸.減少乙酸的戰(zhàn)略減少乙酸的戰(zhàn)略:限制性流加葡萄糖限制性流加葡萄糖甘油替代葡萄糖甘油替代葡萄糖降低培育溫度降低培育溫度 宿主菌宿主菌 降低比生長速率降低比生長速率 透析培育透析培育了解生物技術(shù)的運(yùn)用了解生物技術(shù)的運(yùn)用不同的細(xì)胞具有不同最正確 pH范圍pH 能影響葡萄糖和谷氨酰胺的代謝，在低pH條件下，葡萄糖耗費(fèi)速度慢pH能影響細(xì)胞的生長和目的產(chǎn)物的量Effects of pH on IgGProduction0102030406.877.2 7.4 7.6pH Unitslog H+ 在細(xì)胞培育過程中，在細(xì)胞培育過程中，CO2 與碳酸氫鹽構(gòu)成緩沖

8、對，穩(wěn)定培育與碳酸氫鹽構(gòu)成緩沖對，穩(wěn)定培育液中的液中的 pH CO2也可用于計算呼吸商，反響細(xì)胞活力和代謝旺盛程度也可用于計算呼吸商，反響細(xì)胞活力和代謝旺盛程度 細(xì)胞代謝呼吸作用會產(chǎn)生細(xì)胞代謝呼吸作用會產(chǎn)生CO2 (廢物廢物) CO2 程度添加會抑制細(xì)胞生長和細(xì)胞活性，從而影響目的蛋程度添加會抑制細(xì)胞生長和細(xì)胞活性，從而影響目的蛋白的表達(dá)，當(dāng)溶液中白的表達(dá)，當(dāng)溶液中CO2到達(dá)到達(dá)14-15%時，會嚴(yán)重抑制細(xì)胞的時，會嚴(yán)重抑制細(xì)胞的生長生長CO2 + H2O H2CO3 H+ + HCO3-葡萄糖等需氧來氧化產(chǎn)生ATP供細(xì)胞的能量用于丈量和跟蹤細(xì)胞耗費(fèi)氧的速率.Oxygen Consumptio

9、n Rate of Cells inCulture00.10.20.31015202530354045Time (min)O2:mmol/L 在細(xì)胞培育和發(fā)酵過程中，在細(xì)胞培育和發(fā)酵過程中，O2 通常是限制營養(yǎng)成分，是由通常是限制營養(yǎng)成分，是由于它在溶液中低溶解度于它在溶液中低溶解度: 通常關(guān)懷對培育液中通常關(guān)懷對培育液中 % O2, 也就是也就是“溶氧溶氧 值值 (DO): 實際實際DO: 80% +/- 5 % (哺乳動物細(xì)胞培育哺乳動物細(xì)胞培育) 90 % DO2 (細(xì)菌培育細(xì)菌培育 O2 也能夠經(jīng)過自在基構(gòu)成對細(xì)胞呵斥損傷也能夠經(jīng)過自在基構(gòu)成對細(xì)胞呵斥損傷,在低在低pO2 程度，程度，

10、細(xì)胞的活性通常越高細(xì)胞的活性通常越高 (O2 值必需維持在最低的程度值必需維持在最低的程度) 然而然而, 原代細(xì)胞能夠在低原代細(xì)胞能夠在低 O2 條件下繁衍受延遲條件下繁衍受延遲 因此，維持正確的因此，維持正確的O2的平衡，對保證一切細(xì)胞正確生長的平衡，對保證一切細(xì)胞正確生長都非常重要都非常重要,普通普通30-50%葡萄糖兩個主要的功能:細(xì)胞的主要的能量物質(zhì)主要的細(xì)胞碳源葡萄糖和谷氨酰胺是相互補(bǔ)充的:產(chǎn)生其他代謝物 (例如: 天冬氨酸)提供能量在一切細(xì)胞中經(jīng)過糖酵解途徑轉(zhuǎn)變成丙酮.葡萄糖的代謝隨細(xì)胞生長而添加. 葡萄糖通常是細(xì)胞生長的限制要素Gluc & Cell Density vs Tim

11、e in Batch Culture012345601530456075808590Time (min)Gluc (mmol)00.511.52Cell Count (cells/ml) 監(jiān)控細(xì)胞反響器和發(fā)酵罐中的葡萄糖程度監(jiān)控細(xì)胞反響器和發(fā)酵罐中的葡萄糖程度: 保證細(xì)胞正常生長所需能量保證細(xì)胞正常生長所需能量. 開發(fā)延伸細(xì)胞培育周期的規(guī)范補(bǔ)料戰(zhàn)略開發(fā)延伸細(xì)胞培育周期的規(guī)范補(bǔ)料戰(zhàn)略. 計算葡萄糖耗費(fèi)速率和決議批次培育最正確的起始濃度計算葡萄糖耗費(fèi)速率和決議批次培育最正確的起始濃度.在培育過程中，大多數(shù)乳酸來自于葡萄糖代謝，但也有一部分來自于谷氨酰胺代謝.基于高細(xì)胞密度和深液位，氧的耗費(fèi)非常大.

12、典型的范圍 (組織培育): 0 - 5 g/LO2 耗費(fèi)導(dǎo)致乳酸的構(gòu)成，最終導(dǎo)致pH的下降. 對恒定的 pH:抑制細(xì)胞生長的乳酸程度在低到 4 mM 到高達(dá) 70 mM (取決于細(xì)胞).在大多數(shù)情況下，銨對細(xì)胞生長的抑制比乳酸更嚴(yán)重.Gluc & Lact in Batch Culture05101520250123456Time (days)Gluc/Lact mMLactGluc 監(jiān)控長時間細(xì)胞培育中乳酸的積累監(jiān)控長時間細(xì)胞培育中乳酸的積累. 計算乳酸產(chǎn)量與葡萄糖的耗費(fèi)之間的代謝關(guān)系計算乳酸產(chǎn)量與葡萄糖的耗費(fèi)之間的代謝關(guān)系 調(diào)查乳酸鹽對細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的毒害影響調(diào)查乳酸鹽對細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的毒害影

13、響細(xì)胞培育和發(fā)酵中銨的來源:主要來源: 代謝谷氨酰胺(谷氨酰胺降解)谷氨酰胺降解成銨和吡咯烷酮酸其他氨基酸的脫氨基作用銨的程度也取決于細(xì)胞密度和細(xì)胞代謝方式.引起細(xì)胞抑制的銨離子濃度范圍: 從:0.5 mM (L Mouse Cells)到:40.0 mM (M. Ascites Tumor Cells)(不同的細(xì)胞株對銨有不同的耐受度)Cell Counts vs Ammonia Levels OverTime0501001502002503003504004505001234567Time (min)Cell Density (cells/ml)012345678Ammonia (mM)C

14、.D.NH3pH 會受會受 NH3添加的影響添加的影響:NH4+ NH3 + H + 銨的添加也會改動細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的運(yùn)動銨的添加也會改動細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的運(yùn)動.監(jiān)控發(fā)酵監(jiān)控發(fā)酵罐和生物反響器中銨的程度廢物罐和生物反響器中銨的程度廢物.推算谷胺酰胺的降解程度推算谷胺酰胺的降解程度.調(diào)查銨濃度對細(xì)胞密度和產(chǎn)物濃度的影響調(diào)查銨濃度對細(xì)胞密度和產(chǎn)物濃度的影響.監(jiān)控引入培育基的質(zhì)量監(jiān)控引入培育基的質(zhì)量. 添加換液的速率添加換液的速率 ( (補(bǔ)料補(bǔ)料).). 維持培育液中低的谷氨酰銨濃度減少其轉(zhuǎn)化和降解維持培育液中低的谷氨酰銨濃度減少其轉(zhuǎn)化和降解. . 在低的在低的 pH pH培育減少培育減少NH3NH3構(gòu)成

15、構(gòu)成. . 去除培育液中的銨去除培育液中的銨: : 酶轉(zhuǎn)化酶轉(zhuǎn)化 經(jīng)過特殊的經(jīng)過特殊的 “PTFEPTFE 膜將膜將 NH3 NH3 分散到低分散到低pH pH 溶液中溶液中 運(yùn)用可以逐漸接受高運(yùn)用可以逐漸接受高 NH3 NH3 濃度的細(xì)胞濃度的細(xì)胞 與葡萄糖一樣與葡萄糖一樣, , 谷氨酰胺也是細(xì)胞的主要物質(zhì)谷氨酰胺也是細(xì)胞的主要物質(zhì): :* * 碳和氮碳和氮* * 能量能量 谷氨酰胺通常被以為是細(xì)胞培育的主要限制營養(yǎng)谷氨酰胺通常被以為是細(xì)胞培育的主要限制營養(yǎng) 谷氨酰胺是生物合成的前體物質(zhì)谷氨酰胺是生物合成的前體物質(zhì): : * * 嘌呤嘌呤* * 嘌呤核苷嘌呤核苷 谷氨酰胺是合成嘧啶，氨基糖和

16、天冬的主要氨基受體谷氨酰胺是合成嘧啶，氨基糖和天冬的主要氨基受體 監(jiān)控谷氨酰胺的程度監(jiān)控谷氨酰胺的程度: 確保細(xì)胞生長所需的能量確保細(xì)胞生長所需的能量. 開發(fā)長時間細(xì)胞培育規(guī)范化補(bǔ)料戰(zhàn)略開發(fā)長時間細(xì)胞培育規(guī)范化補(bǔ)料戰(zhàn)略. 計算谷氨酰胺的耗費(fèi)速率和決議批次培育最正確的其計算谷氨酰胺的耗費(fèi)速率和決議批次培育最正確的其始濃度始濃度. 需用來計算谷氨酰胺需用來計算谷氨酰胺 需確證谷氨酸需確證谷氨酸 的濃度，確保沒加進(jìn)谷的濃度，確保沒加進(jìn)谷氨酰胺結(jié)果氨酰胺結(jié)果. 谷氨酰胺的降解產(chǎn)物谷氨酰胺的降解產(chǎn)物Na-K:對適宜培育基消費(fèi)很重要對適宜培育基消費(fèi)很重要.維持溶液維持溶液/培育基適宜的離子強(qiáng)度培育基適宜的離子強(qiáng)度. 浸透壓是溶液濃度的一個反響浸透壓是溶液濃度的一個反響: : 測定浸透壓的參考方法是運(yùn)用浸透壓計測定浸透壓的參考方法是運(yùn)用浸透壓計 典型細(xì)胞培育液浸透壓值典型細(xì)胞培育液浸透壓值: :300 +/-30 mOsmol/kg.300 +/-30 mOsmol/kg. 浸透壓升高浸透壓升高 50-100 m