人血清中小分子蛋白質分離電泳方法改進(1)

1、人血清中小分子蛋白質分離電泳方法改進(1)目的 建立一種靈敏易行分離分子量10 000 Da低豐度蛋白質的電泳方法。方法 用Hitrap Blue層析柱去除血清中白蛋白，用U9對血清樣品進行變性處理，采用改進后的方法(01%甲醇，05%三氯乙酸，01%考馬斯亮藍G250)進行染色。結果 經(jīng)去除血清中的白蛋白、對樣品進行變性處理及改進染色方法后，分辨率和靈敏度明顯提高，可有效分離10 000 Da以下的小分子蛋白質。結論 改進后的電泳方法，不僅簡便靈敏，而且還有利于蛋白質的洗脫回收。關鍵詞： 聚丙烯酰胺凝膠電泳；蛋白質；分離Separation of micro molecular protei

2、n in human serum with improved Tricine-SDS-PAGE system Gangxi Center For Disease Control and Prevention(Nanning 530021,China)Abstract： Objective To separate less abundant proteins less than 10 000 Da with an effective Tricine-SDS-PAGE system.Methods The human serum albumin was removed by Hitrap Blue

3、 column,and serum was dealed with U9.Then gel was stained by the improved method(01% carbinol,05% TCA,01%Coomassie briliant blue G250).Results The discovery and detection of less abundant proteins less that 10 000 Da were improved obviously by removal of human serum albumin,serum treated with U9 and

4、 improvement of staining.Conclusion The improved Tricine-SDS-PAGE system is not only effective to resolve these less abundant proteins less than 10 000 Da,but also favourable to recover these proteins from gel.Key words： SDS-PAGE;protein;separation患者血清中某些小分子蛋白標志物可以用于疾病監(jiān)測和快速診斷，但分離分子量10000Da的小分子蛋白質面臨很

5、多問題。三(羥甲基)甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠電泳(TricineSDSPAGE)是目前一種有效分離小分子蛋白、多肽的電泳方法，可以用于分離小至1kDa的小分子肽1。但其分離效果與樣品處理、樣品中目的蛋白含量以及染色方法等密切相關。文獻報道，使用TricineSDSPAGE分離小分子蛋白的樣品多為蛋白質標準品1-3。作者在分離小分子肽的實驗中發(fā)現(xiàn)，根據(jù)文獻報道的方法，對于分離蛋白標準品或高豐度蛋白效果尚可，但直接用于分離人血清中低豐度的小分子蛋白效果并不理想。因此，作者在樣品的處理、染色等方面進行改進，建立了一種效果理想、簡便靈敏的分離人血清中小分子蛋白質的方法。結果報告如下。1 材料與方法11

6、 材料111 試劑與儀器 磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、尿素、丙烯酰銨、N，N-甲叉雙丙烯酰銨、過硫酸銨、鹽酸、氫氧化鈉、甘油、溴酚藍、三氯乙酸(TCA)、甲醇、戊二醛、醋酸、考馬斯亮藍G250、低分子量蛋白質標準品、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、三羥甲基甲基甘氨酸(Tricine)、二硫蘇糖醇(DTT)、3-(3-膽酰胺丙基)-二乙胺-丙磺酸(CHAPS)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)(上海生工生物工程有限責任公司)；AKTA Purifier-900層析系統(tǒng)、Hitrap Blue層析柱(美國Amersham Biosciences公司)；Power Pac HC

7、TW電泳儀、Mini Protean 3well垂直電泳槽(美國Bio-Rad公司)；搖床(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。112 樣品 樣品取自廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院經(jīng)病理診斷的肝細胞癌患者血清。12 方法121 溶液配制 (1)層析緩沖液配制：結合緩沖液為390ml的20mmol NaH2PO4和610ml的20mmol Na2HPO4溶液混合成1000ml的磷酸鹽緩沖液，用HCl調pH值至70。用配制好的結合緩沖液配500ml的2mol NaCl磷酸鹽洗脫緩沖液。(2)凝膠貯存液配制：A貯液為495%丙烯酰銨總濃度，3%交聯(lián)度的丙烯酰銨貯存液：稱取48g丙烯酰銨和15g N，N-

8、甲叉雙丙烯酰銨，溶于100ml雙蒸水，溶液混勻后經(jīng)濾紙過濾。B貯液為495%丙烯酰銨總濃度，6%交聯(lián)度的丙烯酰銨貯存液：稱取465g丙烯酰銨和3g N，N-甲叉雙丙烯酰銨溶于100ml雙蒸水，溶液混勻后經(jīng)濾紙過濾。膠緩沖液為3mol Tris，03g/L SDS用HCl調pH值至845。(3)蛋白質電泳溶液配制：陽極緩沖液為02 mol Tris,用HCl調pH值至89，陰極緩沖液為01mol Tris，01mol Tricine，03g/L SDS用HCl調pH值至825。(4)樣品緩沖液配制：3mol Tris(pH 845)，24 ml甘油，08g SDS,03mol DTT，少許溴酚藍

9、，定容至10ml。122 層析柱去除白蛋白 凍融血清，4，12000r/min，離心5min，取上清液1ml，用9ml結合緩沖液按19比例稀釋上樣于Hitrap Blue層析注，在AKTA Purifier900層析系統(tǒng)上進行層析分離，用磷酸鹽洗脫緩沖液以流速2ml/min進行洗脫。在層析過程中，AKTA Purifier900層析系統(tǒng)自動收集未與層析柱結合部分的溶液和洗脫液(1ml/管)，并繪出280nm波長處的吸光度(A280nm)曲線。123 膠的制備 按文獻2分別配制分離膠、間隙膠和濃縮膠，依次灌膠。124 樣品處理 將樣品1(未與層析柱結合部分的溶液)和樣品2(洗脫液)，分別倒入30

10、00Da的超濾離心管，4，12000r/min，離心濃縮2h，濃縮體積至1ml。分別加入到含2ml U9緩沖液(9mol Urea,2%CHAPS,1%DTT)的離心管，400600r/min冰浴振蕩30min。取樣品1、2分別與樣品緩沖液等體積混勻，60水浴加熱5min。125 電泳條件 內槽裝陰極緩沖液，外槽用陽極緩沖液恒壓電泳，先40 V約15 h，當樣品進入分離膠時，電壓升至60V約15h。126 染色和脫色 電泳結束時，用雙蒸水把膠面洗凈。分別采用方法1：置于新鮮配制的5%戊二醛溶液中固定，5060r/min，振蕩1h。然后用雙蒸水洗凈膠面，用含0025%考馬斯亮藍G250的10%醋

11、酸溶液染色，5060r/min，振蕩1h，最后轉至10%醋酸溶液脫色，直到背景清晰。方法2：置于染色液(01%甲醇，05%TCA，01%考馬斯亮藍G250)中，5060r/min，振蕩染色1h。然后用雙蒸水洗凈膠面，轉至雙蒸水脫色，1h。更換雙蒸水2次，直到背景清晰。2 結果21 層析柱去除血清白蛋白前后的比較(圖1，圖2) 血清經(jīng)Hitrap Blue層析柱分離后，得到2個吸收峰，分別命名為組分、組分。組分為未與層析柱結合的蛋白質，組分為白蛋白洗脫液。組分、與血清原樣的電泳結果比較顯示，血清原樣白蛋白污染嚴重，組分經(jīng)去除白蛋白后，白蛋白污染顯著減少，電泳可分離出10000Da以下的小分子蛋白

12、質。作者：韋霄，何敏，農炳金，蔣智華，覃健，張志勇 【關鍵詞】,聚丙烯酰胺凝膠電泳；蛋白質；分離摘 目的建立一種靈 本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡上收集整理餅投稿至本站的，論文版權屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權益，請聯(lián)系我們。圖1 經(jīng)Hitrap Blue層析柱分離的各組分（略）A：低分子量蛋白質標準品；B：血清原樣；C：組分；D：組分圖2 不同組分電泳結果比較（略）22 樣品用U9處理前后比較(圖3) 組分用U9處理前后的凝膠圖顯示，未用U9處理的樣品，分離10000Da以下的小分子蛋白效果不佳；用U9處理后的樣品，

13、10000Da以下的小分子蛋白清晰可見。23 不同染色方法比較(圖4) 相同樣本凝膠分別用方法1和方法2進行考馬斯亮藍染色。結果顯示，用方法1染色，凝膠背景顏色深，分離10000Da以下的小分子蛋白效果不佳；用方法2染色，凝膠背景顏色淺，10000Da以下的小分子蛋白清晰可見。3 討論本實驗采用的TricineSDSPAGE方法與目前國內外采用的相似，可有效分離小分子蛋白和多肽1-3。但用此法直接分離未經(jīng)任何處理的人血清時效果不佳，可能與血清中小分子目的蛋白的含量太低有關。利用Hitrap Blue層析柱去除白蛋白后，不僅可以增加電泳樣品的上樣量，還可分辨出10000Da以下的小分子蛋白質或多

14、肽。本實驗還發(fā)現(xiàn)，樣品經(jīng)含尿素、CHAPS和DTT的U9處理后，有助于分離小分子蛋白。U9可以斷裂蛋白質間的氫鍵和二硫鍵，使疏水相互作用被取消，多肽被去折疊，從而提高電泳中蛋白的分辨率5，6。此外，快速的固定、染色和脫色對于提高小分子多肽電泳的分辨率也是必的，這主是由于小分子多肽對染料的結合力較弱，易擴散沖洗掉而著色較差2。傳統(tǒng)的染色方法多采用甲醛、甲醇7、戊二醛8、乙酸和乙醇9等進行固定、染色和脫色，但小分子多肽有時很難被固定，且染色背景較深，脫色時間長，大大降低了分辨率和靈敏度。本實驗應用經(jīng)過改良的染色液配方，用1%濃度的三氯乙酸代替高濃度的乙酸，甲醇濃度也只有01%，染色和脫色時間相對較

15、短，使染色液檢測靈敏度提高，可以檢測10ng/條帶的蛋白質。而且染色過程中由于背景顏色很淺，可以隨時看到染色的進度。脫色過程簡便易行，只需用水，不需用緩沖液反復沖洗脫色。但如果用水沖洗，能得到透明無色背景，可以進一步提高檢測靈敏度。A：低分子量蛋白質標準品；B：用U9處理后的樣品；C：未用U9處理樣品圖3 樣品用U9處理前后的比較（略）A：低分子量蛋白質標準品；B：方法1；C：方法2圖4 不同染色方法的比較（略）參考文獻1 曹佐武.有效分離1 KDa小肽的TricineSDSPAGE方法J.中國生物工程雜志，2004，24(1)：74-76.2 石繼紅，趙永同，王俊樓，等.SDS-聚丙烯酰胺凝

16、膠電泳分析小分子多肽J.第四軍醫(yī)大學學報，2000，21(6)：761-763.3 Schagger H,von Jagow G.Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamid gel electroporesis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDaJ.Analytical Biochemistry,1987,166(2):368-397.4 Steel LF,Trotter MG,Nakajima PB,et al.Efficient and specific removal of albumin from human serum samplesJ.Molecular&Cellular Proteomics,2003,2(4):262-270.5 張群業(yè)，黃秋花，沈樹紅，等人APL細胞株NB4不同二維電泳條件對電泳結果的影響J.中國實驗血液學雜志，2004，12(4)：401-405.6 Lanne B,Potthast F,Hoglund A,et al.Thiourea enhances mapping of th