T-AK細胞和IL-2脂質(zhì)體聯(lián)合硒酸酯多糖抗白血病效應(yīng)的研究

1、    T-AK細胞和IL-2脂質(zhì)體聯(lián)合硒酸 酯多糖抗白血病效應(yīng)的研究        【摘要】目的研究抗CD3單克隆抗體與IL-2共同誘導(dǎo)的T-AK細胞和IL-2脂質(zhì)體(L-IL-2)聯(lián)合硒酸酯多糖(KSC)對L1210小鼠白血病的治療作用。 方法用DBA/2小鼠建立L1210白血病模型，正常小鼠脾細胞誘生制備T-AK細胞，按設(shè)計方案轉(zhuǎn)輸T-AK細胞和IL-2脂質(zhì)體，KSC灌胃，檢測NK細胞活性、脾淋巴細胞增殖活性和IL-2誘生水平，觀察荷瘤小鼠生存期。 結(jié)果L12

2、10白血病小鼠的免疫功能急劇降低，生存期為16.43±1.92天；轉(zhuǎn)輸T-AK細胞(5×106)和L-IL-2(104U/kg)能部分逆轉(zhuǎn)白血病小鼠低下的細胞免疫功能，生存期延長(24.78±3.94天)，并有14.3%小鼠長期存活； KSC(40mg/kg)對T-AK/L-IL-2的抗白血病作用有明顯的增強效應(yīng)，荷瘤小鼠細胞免疫功能進一步增強，生命延長率、長期存活率分別提高36%和99.9%。 結(jié)論硒酸酯多糖具有生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(BRM)樣作用；以應(yīng)用T-AK細胞和IL-2脂質(zhì)體為主體，硒酸酯多糖為輔佐的生物治療方案對白血病小鼠具有顯著的免疫抑瘤作用?！局黝}詞】T

3、-AK細胞白細胞介素2脂質(zhì)體硒酸酯多糖L1210白血病小鼠生物治療 Experimental study on antileukemia effects of anti-CD3/interleukin-2 costimulated killer cells and interleukin-2 liposomes plus kappa-selenocarrageenanWei Hulai,Jia Zhengping, Zhao Huaishun,et al. Institute of Hematology,Lanzhou Medical College, Lanzhou 730000【Abstr

4、act】ObjectiveTo study the antileukemia and immunomodulating effect of T-activated killer (T-AK) cells induced by anti-CD3antibody and interleukin-2 costimulation and liposomalinterleukin-2 (L-IL-2) plus kappa-selenocarrageenan (KSC)on L1210 leukemia mice. MethodsT-AK cells were induced in splenocyte

5、s from normal DBA/2 mice with anti-CD3 monoclonal antibody and rIL-2.The murine L1210 leukemia model wasestablished by ip injection of L1210 cells in DBA/2 mice, and according to the experimental protocol the L1210-bearing mice were administrated with adoptive transfer of T-AK cells plus L-IL-2 (T-A

6、K/L-IL-2) and KSC. The cellular immune functions and thelife spans of the mice were determined. ResultsAfter tumor inoculation the cellular immune functions of L1210-bearing mice decreased significantly, and their life spans were 16.43±1.92 days. Adoptively transfected T-AK cells (5×106/mi

7、ce) and L-IL-2 (104U/kg) could partly reverse the decreasetendency of lymphocytic proliferation activity,NKcytotoxicity and IL-2 producing ability of the leukemia mice, and the survival time of the tumor-bearing mice was prolonged to24.78±3.94 days (P<0.01), and 14.3% of the leukemic micewer

8、e cured. KSC (40mg/kg) enhanced markedly the antileukemicand immunopotentiating activities of T-AK/L-IL-2 therapy. The rate of life prolongation was 36%,and the cure rate of the leukemia mice was doubled. ConclusionsKSC possess the activities of biological response modifier (BRM).The biotherapeutic

9、program of T-AK cells and IL-2 liposomes with adjuvant of BRM-like immunocompetent potentiator KSC has great antitumor and immuno-potentiating actions on murine L1210-leukemia.【Subject words】T-AK cellsInterleukin-2LiposomesKappa-selenocarrageenanL1210 leukemic miceBiotherapy腫瘤生物治療已在臨床實踐中取得了一定的療效， 但該

10、療法普遍存在療效不高，大劑量使用rIL-2 產(chǎn)生毒副作用等問題。 國內(nèi)外學(xué)者在rIL-2/LAK療法的基礎(chǔ)上，通過改進效應(yīng)細胞的誘導(dǎo)方法以產(chǎn)生增殖快、殺傷活性高的效應(yīng)細胞，改變輸注途徑，應(yīng)用能增強效應(yīng)細胞活性的物質(zhì)等手段來提高療效。本研究將根據(jù)Loeffler1 的培養(yǎng)系統(tǒng)誘導(dǎo)激活的小鼠T-AK(T-activated killer)細胞和IL-2脂質(zhì)體 (interleukin-2 liposomes, L-IL-2)，用于治療小鼠L1210白血病模型， 并觀察了硒酸酯多糖(Kappa-selenocarrageenan,KSC)對T-AK/L-IL-2療法的增強效應(yīng)。材料與方法1.主要試劑

11、 ： 重組白細胞介素-2(深圳新生命藥業(yè)有限公司，凍干品，5×104U/瓶)；抗小鼠CD3-鏈單抗(CD3 McAb，145-2Cll，PharMingen)； MTT、ConA(Sigma產(chǎn)品)，硒酸酯多糖(KSC，北京天賜福生物醫(yī)藥有限公司)， 消炎痛(蘭州醫(yī)學(xué)院鳳山制藥廠)。2.動物：清潔級DBA/2小鼠，雄性，1822g， 購自甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院實驗動物室。3.瘤細胞：L1210細胞(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)、K562細胞( 北京市腫瘤防治所)，Raji細胞(上海生物所)，CTLL-2細胞(上海生化所)，均由本所傳代保種。4.IL-2脂質(zhì)體的制備：采用改良超聲-薄膜法2。

12、5.T-AK細胞的制備：小鼠脾淋巴細胞，5×106/ml接種于含100U/ml rIL-2和2g/ml的CD3 McAb的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)，離心收集，洗滌，用生理鹽水制成含2.5×107/ml細胞和1000U/ml L-IL-2的T-AK細胞懸液，用于治療， 并以MTT法檢測T-AK細胞在體外殺傷Raji和L1210細胞的活性1,3。6.L1210白血病模型：無菌取生長良好的L1210腹水，洗滌，DBA/2小鼠腹腔接種5×104個細胞，24小時后隨機分組，每組10只,并開始治療: 對照組：生理鹽水； T-AK/L-IL-2組：第1,2,3天每鼠各

13、轉(zhuǎn)輸0.2ml T-AK細胞懸液(5×106T-AK，200U L-IL-2)； T-AK/L-IL-2+KSC組： 轉(zhuǎn)輸T-AK細胞和L-IL-2的同時KSC灌胃，每天40mg/kg，共5天。實驗第13天所有小鼠飲水中加入14mg/ml的消炎痛1，實驗第6天每組各殺3只小鼠用于檢測細胞免疫功能，留7只用于觀察生存期。7.淋巴細胞增殖活性：小鼠脾淋巴細胞2×106/ml，用ConA(5g/ml)刺激72小時，MTT法3,4測A570nm值，并計算刺激指數(shù)(SI)：SI=ConA+組A值/ConA?組A值8.NK細胞活性：以小鼠脾細胞為效應(yīng)細胞，K562細胞為靶細胞，效靶為1

14、001和51，MTT法測定3,4。9.IL-2的誘生和活性檢測：小鼠脾細胞以5×106/ml，ConA 10g/ml誘生24小時，4離心收集上清，即為待測樣品，-30保存。標(biāo)準(zhǔn)rIL-2 和待測樣品在96孔板上用1640液倍比稀釋(對照組加1640液)， 加入離心洗滌的CTLL-2為反應(yīng)細胞(3×105/ml)，培養(yǎng)24小時，MTT法測A570nm值。以使CTLL-2細胞50%增殖反應(yīng)的稀釋度計算樣品中IL-2的活性46。結(jié)果1.小鼠脾淋巴細胞誘生的T-AK細胞的體外殺傷活性：從小鼠脾細胞中誘生激活72120小時的T-AK細胞，對Raji細胞的殺傷活性為70.08%

15、7;6.68%，體外殺傷L1210細胞的活性為64.13%±8.61%。(1)淋巴細胞增殖活性：L1210白血病小鼠的脾淋巴細胞增殖活性較正常小鼠降低61%(P<0.01)；轉(zhuǎn)輸T-AK細胞和L-IL-2，以及聯(lián)合應(yīng)用增強劑KSC，可明顯提高脾淋巴細胞增殖活性(P<0.05)，但上述治療均未能使荷瘤小鼠的脾淋巴細胞增殖活性達到正常水平(表1)。表1T-AK/L-IL-2和KSC聯(lián)合治療對白血病小鼠淋巴細胞增殖活性的影響(±s)Table 1. Effect of T-AK/L-IL-2 plus KSC co-therapy onlymphocytic prol

16、iferation of leukemia mice (±s)GroupA570nmSIConA-ConA+NormalLeukemia1.92±0.09T-AK/L-IL-22.45±0.12*T-AK/L-IL-2+KSC3.30±0.17* P<0.01 as compared with normal,* P<0.05 as compared with leukemia (n=3)(2)NK細胞活性：由表2可見，L1210白血病小鼠NK細胞活性低于正常小鼠(P<0.05)，T-AK/L-IL-2轉(zhuǎn)輸及聯(lián)合應(yīng)用KSC，可顯著增強白血

17、病小鼠的NK細胞活性(P<0.05、P<0.01)；聯(lián)合應(yīng)用KSC，NK細胞活性較單純T-AK/L-IL-2治療提高10%30%，特別是在低效靶比時更為顯著。(3)IL-2產(chǎn)生水平：L1210白血病小鼠脾細胞分泌IL-2的能力約為正常小鼠的1/3，T-AK/L-IL-2治療能促進白血病小鼠產(chǎn)生IL-2，提高137.1%；KSC與T-AK細胞聯(lián)合應(yīng)用,可使荷瘤小鼠分泌IL-2水平增高270.32%;比單純T-AK/IL-2治療增高56.13%(表2)。表2T-AK/L-IL-2和KSC聯(lián)合治療對白血病小鼠NK細胞活性和IL-2誘生水平的影響(±s)Table 2. Effe

18、ct of T-AK/L-IL-2 plus KSC co-therapy on NKcell activity and IL-2 level in leukemia mice(±s)GroupNK cell activity (E/T,%)IL- 2 activity(U/ml)100151NormalLeukemia17.61±1.944.64±1.22 29.58±4.32T-AK/L-IL-221.87±4.45*7.65±3.05*70.16±10.08*T-AK/L-IL-2+KSC25.89±2.13

19、*8.46±2.10*109.54±18.89* P<0.05， P<0.01 as compared with normal,* P<0.05 * P<0.01 as compared with leukemia (n=3)3.T-AK/L-IL-2和KSC聯(lián)合治療延長L1210白血病小鼠的生存期： DBA/2小鼠接種 5×104 L1210細胞，100%發(fā)病，第6天時脾臟明顯充血、增大(約為正常小鼠的一倍)，第10天左右出現(xiàn)腹水。對照組小鼠于17天內(nèi)全部死亡，T-AK/L-IL-2可使小鼠的生存期延長50.82%；T-AK/L-IL-2

20、聯(lián)合KSC使小鼠的生存期延長69.20%，后二組分別有14.29%28.57% 的小鼠生存期>60天(表3)。生存期>60天的小鼠處死后檢查發(fā)現(xiàn)脾臟明顯回縮，腹水消失，外周血和腹腔液涂片均未發(fā)現(xiàn)L1210細胞，可視為“治愈”。表3T-AK/L-IL-2和KSC聯(lián)合治療對白血病小鼠生存期的影響(±s)Table 3. Effect of T-AK/L-IL-2 plus KSC co-therapy onsurvival days of leukemia mice (±s)GroupLife spanRate of life prolongation(%)Cure

21、 rate(%)Control16.43±1.92(17.00)T-AK/L-IL-224.78±3.94(25.00)*T-AK/L-IL-2+KSC27.80±3.49(29.00)* P<0.05, * P<0.01 as compared with control,the numbers in the parentheses show the median of the survival days討論以rIL-2/LAK療法為代表的過繼免疫治療在臨床腫瘤的治療中取得了較好的療效。但該療法存在LAK前體細胞數(shù)量有限，LAK細胞靶向性差，大劑量應(yīng)用

22、rIL-2引發(fā)嚴重的毒副反應(yīng)等缺陷1,7。因此研究更為理想的效應(yīng)細胞或誘導(dǎo)激活方式，降低rIL-2的毒副作用， 配伍應(yīng)用增強效應(yīng)細胞活性的物質(zhì)，是改進腫瘤過繼免疫治療的有效途徑。脂質(zhì)體包封的IL-2可通過改變吸收和分布以減輕其毒性作用， 并延長半衰期和提高生物活性，促使殺傷細胞向腫瘤部位遷移1,2。CD3 McAb和rIL-2共同激活誘導(dǎo)的T-AK細胞為異質(zhì)細胞群體，具有LAK細胞和CD3 AK細胞的共同特性1,3。小鼠脾淋巴細胞中誘生的T-AK細胞和IL-2脂質(zhì)體聯(lián)合轉(zhuǎn)輸，L1210白血病小鼠細胞免疫功能增強，生存期延長，并有部分小鼠長期存活。證明T-AK細胞與IL-2脂質(zhì)體聯(lián)合應(yīng)用是較理想

23、的腫瘤(白血病)生物治療手段。應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)劑可增強殺瘤效應(yīng)細胞的活性， 提高其在體內(nèi)的抗腫瘤效果。實驗證明硒和多糖系具有BRM樣作用的免疫活性調(diào)節(jié)劑，具有廣譜防癌抗癌和增強免疫功能的作用8,9。硒酸酯多糖為天然硫酸酯多糖的硒化產(chǎn)物，具有硒和多糖的雙重功效，具有優(yōu)勢互補、彼此協(xié)同增效的特點，兼具殺傷腫瘤細胞和激活免疫活性細胞的作用4, 10。與T-AK/L-IL-2聯(lián)合應(yīng)用，荷瘤小鼠淋巴細胞增殖活性、NK細胞活性和IL-2產(chǎn)生水平較單純T-AK/L-IL-2治療提高35%，18%和56%，生命延長率和長期存活率分別增加36%和100%。表明KSC可作為BRM來增強T-AK/L-IL-2的抗白血病

24、作用。T-AK細胞與IL-2脂質(zhì)體轉(zhuǎn)輸及聯(lián)合應(yīng)用KSC在小鼠L1210白血病模型的治療中取得了良好的效果，據(jù)此建立的以應(yīng)用T-AK細胞和IL-2脂質(zhì)體為主體，BRM樣免疫活性增強劑為輔佐的腫瘤生物治療方案，可望在臨床腫瘤的生物治療中發(fā)揮更大的作用。作者單位：730000 蘭州醫(yī)學(xué)院血液病研究所(魏虎來，趙懷順，馬蘭芳)；蘭州軍區(qū)總醫(yī)院(賈正平)參考文獻1Loeffler CM, Plant JL, Anderson PM,et al.Antitumor effects of interleukin-2 liposomes and anti-CD3-stimulated T-cells against murine MCA-38hepatic metastasis. Cancer Res,1991, 51 2127-2132.2魏虎來,賈正平. Enhan