半枝蓮提取物誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡及其對(duì)凋亡相

1、半枝蓮提取物誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡及其對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響         09-09-13 08:56:00     編輯：studa20                   作者：韋鵬涯 浦洪琴 韋星 賓曉蕓 李朝敢【摘要】  目的探討半枝蓮提取物(Scutellaria ba

2、rbata D. Don extract, SBE)對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2，Survivin和Caspase-3表達(dá)的影響。方法體外培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞，以2.5，5和10 mg·L-1SBE處理48 h，并以2.5 mg·L-1順鉑（DDP）作為陽性對(duì)照。用MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，二步法免疫組化檢測(cè)Bcl-2，Survivin和Caspase-3蛋白表達(dá)。結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，SBE各濃度組細(xì)胞抑制率顯著升高（P0.001），細(xì)胞凋亡率明顯上升（P0.01），Caspase-3蛋白表達(dá)顯著上升（P<

3、;0.01或P<0.05），Bcl-2和Survivin蛋白表達(dá)明顯下降（P<0.01或P<0.05）。結(jié)論 SBE具有誘導(dǎo)肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡的作用，其分子機(jī)制可能與上調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)以及下調(diào)Bcl-2和Survivin蛋白表達(dá)有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  半枝蓮 SMMC-7721細(xì)胞 細(xì)胞凋亡 Bcl-2; Survivin Caspase-3Abstract：ObjectiveTo explore the apoptosis-inducing effect of Scutellaria barbata D. Don extract（SBE）an

4、d the expression of apoptosis associated proteins Bcl-2, Survivin and Caspase-3 on human liver cancer SMMC-7721 cells. MethodsSMMC-7721 cells were treated with 2.5, 5 and 10 mg·L-1 SBE for 48h, and the cells were treated with 2.5mg·L-1 DDP as positive control. The inhibitory rat was evalua

5、ted by MTT assay. The apoptotic rate was determined by flow cytometry. The expression of Bcl-2, Survivin and Caspase-3 proteins were detected by two-step immunohistochemical staining.ResultsCompared with control group, the inhibitory rate was increased obviously(P<0.001), the apoptotic rate was i

6、ncreased markedly(P<0.01), the expression of Caspase-3 protein was increased significantly(P<0.01 or P<0.05), while Bcl-2 and Survivin proteins were decreased markedly (P<0.01 or P<0.05) in SBE groups. ConclusionSBE can induce apoptosis of liver cancer SMMC-7721 cells. The molecular m

7、echanism might be related to up-regulating the expression of Caspase-3 and down-regulating the expression of Bcl-2 and Survivin apoptosis related proteins.Key words：Scutellaria barbata D. Don;   SMMC-7721 cells;   Apoptosis半枝蓮Scutellaria barbata D. Don，SB屬于唇形科植物，臨床上常用于肝癌、肺癌、胃癌和鼻咽

8、癌等多種癌癥防治，但具體的抗癌機(jī)制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，半枝蓮提取物（SBE）能誘導(dǎo)白血病K562細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與Caspase3的表達(dá)升高和活化有關(guān)1；SBE可誘導(dǎo)人肝癌QGY-7701細(xì)胞凋亡，并能上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2的表達(dá)2；SBE還通過上調(diào)凋亡相關(guān)基因蛋白Fas表達(dá)，促進(jìn)人肝癌Hep-G2細(xì)胞凋亡3。本研究觀察了SBE誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡作用，并檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2，Survivin 和Caspase-3表達(dá)情況，以探討SB抗肝癌作用及其初步分子機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1  器材與方法1.1  材料1.1.1  細(xì)

9、胞 人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721由中科院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫提供。1.1.2  試劑與儀器 胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培養(yǎng)基為GIBCO公司產(chǎn)品，碘化丙啶(PI)為Sigma公司產(chǎn)品，四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）為上海普飛生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，鼠抗Bcl-2、Survivin和Caspase-3單克隆抗體為Santa cruz公司產(chǎn)品，PowerVisionTM免疫組化檢測(cè)試劑盒為北京中杉金橋生物技術(shù)公司產(chǎn)品。wellscan K3 酶標(biāo)儀(芬蘭)，BX51型顯微鏡（OLYMPUS），F(xiàn)acscallbar型流式細(xì)胞儀（USA）。1.2 

10、方法1.2.1  藥物提取 按文獻(xiàn)4方法，取SB(購于廣西壯族自治區(qū)百色市中醫(yī)醫(yī)院中藥房)干品粗粉50 g，用75%乙醇浸泡3 h，共浸泡3次，溫度40，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器干燥得SB浸膏，二甲基亞楓（DMSO）溶解浸膏樣品配制成濃度為10mg·ml-1提取物藥液, 再以細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成所需濃度供實(shí)驗(yàn)用。1.2.2  細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理 肝癌SMMC-7721細(xì)胞，以含100 U·ml-1青霉素，100 g·ml-1鏈霉素、10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，在37，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)增殖期，更換

11、含0，2.5，5，10 mg·L-1SBE新鮮培養(yǎng)液，用DDP(2.5 mg·L-1)為陽性對(duì)照組，藥物作用時(shí)間均為48 h。1.2.3  細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)(MTT法) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞移入96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度約為1×104個(gè)/ ml，每孔加入200 l細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h。吸棄孔內(nèi)原培養(yǎng)液，加入含SBE的10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液200 l，每個(gè)藥物濃度設(shè)4個(gè)平行復(fù)孔，另設(shè)DDP為陽性對(duì)照組和空白對(duì)照孔。培養(yǎng)到44 h，每孔加入MTT（5 mg·ml-1）20 l，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，小心吸棄

12、孔內(nèi)上清液，每孔加入DMSO 150 l，用震蕩混合儀震蕩10 min。選擇492 nm波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定每孔光吸收值（OD值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按下公式計(jì)算抑制率：抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。1.2.4  流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡藥物作用后，收集各組細(xì)胞約1×106個(gè)，1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液；PBS沖洗2次，加入70%預(yù)冷的乙醇固定，4，124 h；離心棄去固定液，PBS沖洗去乙醇；PBS重懸細(xì)胞，400目的篩網(wǎng)過濾1次，離心棄去PBS；加入RNase A(終濃度為60 g·ml-1)，搖勻，37溫育3

13、0 min，加入PI(終濃度為50 g·ml-1)，4避光30 min；每份標(biāo)本測(cè)定(24)×103個(gè)細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用MoufitLT軟件分析結(jié)果。1.2.5  免疫組化法檢測(cè)基因蛋白表達(dá) 按照二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒說明書操作：藥物處理細(xì)胞后，收集細(xì)胞，PBS沖洗兩次；制成細(xì)胞懸液涂片，風(fēng)干后丙酮固定15 min；3%過氧化氫孵育5 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；滴加一抗（稀釋1100），室溫90 min，PBS沖洗，2 min×3次；滴加IgG抗體-HRP多聚體20-30  min，PBS沖洗，5 min×3次；用DAB溶液顯色；蒸餾水沖洗、蘇木素襯染、脫水、封片。以PBS代替一