豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP3_GP5_M真核表達載體的構(gòu)建及其體液免疫應(yīng)答

1、（）：畜牧獸醫(yī)學(xué)報，豬繁殖與呼吸綜合征病毒真核表達載體的構(gòu)建及其體液免疫應(yīng)答王凡，劉建斌，祝秀梅，呂志慧，馬全英，杜平，劉學(xué)榮，牟克斌（）蘭州蘭州中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，摘要：本試驗旨在構(gòu)建表達豬繁殖與呼吸綜合征病毒（）、和蛋白的真核重組質(zhì)粒。以采用將擴增的株為模板，方法擴增出、基因片段，、通過序列串聯(lián)成然后將構(gòu)建重組質(zhì)粒將其轉(zhuǎn)染（與），雙酶切后插入間接免疫熒光檢測細胞。鑒定表明重組質(zhì)粒含有、基因，表明并、蛋白在細胞內(nèi)獲得表達。、蛋白獲得正確表達，檢測證實首免后周可檢測到且所表達的、蛋白是融合蛋白。將免疫小鼠，特異性首免后周中和抗體效價最高可達中和抗

2、體，。進一步將免疫斷奶仔豬，首免后周即可產(chǎn)生的中和抗體。本試驗成功構(gòu)建了表達、和融合蛋白的中和抗體檢測表明從而為真核重組質(zhì)粒，具有良好的免疫原性，基因工程疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。；關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒（）蛋白；蛋白；蛋白（）中圖分類號：文獻標識碼：文章編號：，（，；，）：，（），（），收稿日期：，：作者簡介：王凡（女，甘肅定西人，助理研究員，碩士，主要從事動物病毒免疫學(xué)研究，；）：，：牟克斌，研究員，通訊作者：期真核表達載體的構(gòu)建及其體液免疫應(yīng)答王凡等：豬繁殖與呼吸綜合征病毒：，：，：；（）；豬繁殖與呼吸綜合征（，是由豬繁殖與呼）吸綜合征病毒（，引起豬的一種高度接）臨床上以母豬發(fā)熱、厭食

3、和流產(chǎn)、死胎、觸性傳染病，木乃伊胎、弱仔等繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征，發(fā)病率高、傳播快，嚴重危害養(yǎng)高效的豬業(yè)的發(fā)展。研制開發(fā)新型、核酸疫苗對控制該病的發(fā)生具有重要意義。是一種有囊膜的單股正鏈病毒，基因組長約有個不同程度的開放閱讀框，（），即。由基因編碼，是一種糖基化蛋白，在病毒的致病性、復(fù)制、裝。配、變異和保護性反應(yīng)等方面具有重要意義（載體由本實驗室保存。）主要試劑病毒總超純質(zhì)粒提取試劑提取試劑盒、盒均購自公司，反轉(zhuǎn)錄酶、聚合酶、質(zhì)粒提取試劑盒等均購自寶生物工程（大連）、有限公司，等限制性內(nèi)切酶購自公司，購自公司，凝膠回收試劑盒購自公司，轉(zhuǎn)染試劑購自公司，標記的兔抗豬和標記的

4、兔抗豬均購自公司，陽性豬血清為本實驗室制備。引物設(shè)計參照登錄號為發(fā)表的序列（），設(shè)計對引物，由上海英駿生物技術(shù)）。有限公司合成（表病毒提取待接種細胞長成單層后，培養(yǎng)當細胞出現(xiàn)株，以上病變時收獲病毒懸液。按病毒總提取試劑盒操作說明，從細胞培養(yǎng)毒液中提取。目的基因擴增將提取的總在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下于、進行反轉(zhuǎn)錄制備成。然后以、，為引物分、別擴增和基因。以和混合物為模板，以擴增得到、為引物，連接分別篩。膠回收純化，載體，選含分和基因片段的陽性重組質(zhì)粒，別命名為酶切、，將獲得的質(zhì)粒送上海桑尼生物科技有和鑒定，限公司測序。等報道用桿狀病毒表達的的基因產(chǎn)物免疫母豬，對懷孕母豬可以提供的保護，因此研究和分析該

5、蛋白的免疫特性及其功能力具有十分重要的理論意義。由基因編是碼，的重要結(jié)構(gòu)蛋白和免疫保護性蛋白之一，且能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，對于研究基因工。由程疫苗和診斷抗原具有重要意義編碼，在所有的該蛋白具有株間高度保守，很強的免疫原性，感染即可激發(fā)可檢測的抗體。應(yīng)答作者擬構(gòu)建表達、和蛋白的真核重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染為細胞，多基因核酸疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。材料與方法材料豬繁殖與呼吸綜合征病料采自遼寧某豬場；細胞購自中國科學(xué)院細胞庫中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心；載體購）自大連寶生物（公司；細胞、表擴增目的片段的引物引物名稱畜牧獸醫(yī)學(xué)報卷）引物序列（酶切位點片段長度；（）（；真核重組質(zhì)粒的構(gòu)建將質(zhì)粒經(jīng)、酶切

6、后連接至經(jīng)相同酶切的載體構(gòu)建重組質(zhì)粒將；質(zhì)粒經(jīng)酶切和后連接至經(jīng)相同酶切的構(gòu)建。按在常規(guī)方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，挑選克隆后，提取質(zhì)抗性的瓊脂平板上篩選，得到陽性重粒。采用酶切、擴增等方法鑒定，組質(zhì)粒，命名為。重組質(zhì)粒在細胞中的表達提取質(zhì)粒用，轉(zhuǎn)染試劑按操作說明進行轉(zhuǎn)染。按常規(guī)方法對其進行和間接免疫熒光檢測（鑒定。）將轉(zhuǎn)染的細胞棄營養(yǎng)液，用洗滌在轉(zhuǎn)染后，（）次，加固定用預(yù)冷的乙醇，；漂洗次后空氣干燥，加入稀釋的陽加入性豬血清，作用；漂洗次后，）稀釋，標記的兔抗豬（作用；風(fēng)干后直接觀察熒光。同時以漂洗次，轉(zhuǎn)染的細胞作對照。表達產(chǎn)物的檢測如上所述，將和轉(zhuǎn)染細胞，后收集細胞，離心取沉淀，加入細胞裂

7、解液，再加入煮沸按照常規(guī)法上樣緩沖液，進行轉(zhuǎn)膜，分別加電泳，稀釋的陽性豬血清和標記的兔抗豬（），進行免疫印跡。小鼠和仔豬免疫及中和抗體檢測購自蘭州生物研究所周齡小鼠只（，實驗動物中心）隨機分為組，每組只。第組肌肉注射第，只，組注射空白載體作為陰性對照。免疫每次間隔周。次，購日齡陰性的斷奶長白仔豬頭（自蘭州豬場）作為免疫用豬，隨機分為組，每組頭。設(shè)、空白載體肌注間隔周兩個免疫組，頭，免疫次，共次。，被檢血清倍比稀釋后（滅活）加入每孔孔細胞培養(yǎng)板中，。然后每孔加入用稀釋為（）的，再，培養(yǎng)箱中作用于每孔中滴加個細胞的輕輕混勻后，繼續(xù)培養(yǎng)細胞懸液，逐日觀察細胞病變情況，記錄被檢血清中抗即被檢血清樣品能

8、的特異性中和抗體效價，夠完全保護細胞不發(fā)生病變的最高稀釋倍數(shù)。結(jié)果目的基因制備分擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析表明，別擴增出與、和基因相應(yīng)的約，圖）、和大小的特異片段（與預(yù)期大小相符。期 真核表達載體的構(gòu)建及其體液免疫應(yīng)答王凡等：豬繁殖與呼吸綜合征病毒、基因；相對分子質(zhì)量標準，；圖目的基因的擴增結(jié)果重組質(zhì)粒；陰性對照；圖檢測重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞中蛋白的表達（）真核重組質(zhì)粒的構(gòu)建將所獲得的含有和基因的重組質(zhì)粒和分別用得到的片段與和雙酶切后，、，圖）、鑒定也出現(xiàn)同基因相符（通過測序得知樣大小的片段，、基因片，段已經(jīng)按預(yù)期成功插入表達載體）（證明真核重組質(zhì)粒已構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒在細胞中的表達將酶切、和測序

9、鑒定篩選出的重組質(zhì)粒細胞后，轉(zhuǎn)染到通過間接免疫熒光試驗，在細胞質(zhì)中觀察到特異性的，圖）表明該重組質(zhì)粒被成功轉(zhuǎn)染到亮綠色熒光（、并成功表達了細胞中，和蛋白 。檢測體外表達將轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的結(jié)果表明，細胞經(jīng)檢測，能夠表達大小約為而用空載體的融合蛋白，） 。圖轉(zhuǎn)染的細胞未出現(xiàn)目的條帶（蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；轉(zhuǎn)染的細胞的裂解產(chǎn)物；圖細胞的轉(zhuǎn)染的分析；相對分子質(zhì)量標準；酶切產(chǎn)物；圖重組質(zhì)粒酶切鑒定 免疫小鼠特異性抗的免疫應(yīng)答采用微量中和抗體檢測方法，檢測首免后第、和周免疫小鼠特異性針對的中和抗體水平，結(jié)果首免后第，周就有只小鼠產(chǎn)生可檢測的中和抗體（隨）后快速上升，于第周達到最高，有只達到了畜牧獸醫(yī)學(xué)報卷

10、（）?？瞻纵d體表陰性對照組在整個試驗過程中均未檢測到特異性針對的中和抗體。說明能夠很好地誘發(fā)免疫小鼠產(chǎn)生較高的中和抗體。表的中和抗體檢測免疫小鼠產(chǎn)生特異性針對處理初免后時間周）（小鼠數(shù)量免疫仔豬特異性抗的免疫應(yīng)答為檢測構(gòu)建的多基因疫苗將重組在本動物豬體內(nèi)的免疫效果，質(zhì)粒免疫分別檢測首免后第、陰性仔豬，、和周免疫豬中和抗體水平。從表中可以看出，表達融合蛋白的免疫豬于首免后第周開始產(chǎn)生可檢測的），于第周達到最高，有頭達到了中和抗體（）?？瞻纵d體表（對照組在整個試驗過程中均未檢測到特異性針對的中和抗體。說明這種表達融合蛋白的多基因疫苗具有誘發(fā)免疫豬產(chǎn)生較高的中和抗體的能力。表的中和抗體檢測免疫仔豬產(chǎn)

11、生特異性針對處理初免后時間周）（仔豬數(shù)量 期 王 凡等： 豬繁殖與呼吸綜合征病毒 真核表達載體的構(gòu)建及其體液免疫應(yīng)答 是抗病毒疫苗研究的主要目標。本研究在小鼠和仔 討 論 是一種以母豬繁殖障礙和新生仔豬 呼 吸 道癥狀及高死亡率 為 主 要 特 征 的 傳 染 病， 幾 乎 遍 已 及世界所有養(yǎng)豬國 家， 養(yǎng) 豬 業(yè) 造 成 了 巨 大 的 直 接 給 經(jīng)濟損失。在 的 防 制 中， 內(nèi) 外 有 關(guān) 專 家 均 國 認為其有效 疫 苗 的 突 破 口 在 于 因 疫 苗， 其 既 能產(chǎn)生強大的細胞 免 疫， 能 篩 選 適 宜 的 抗 原 基 因 又 以避 免 非 中 和 性 抗 體 的 產(chǎn)

12、生 和 其 介 導(dǎo) 的 作用。 的不同蛋白 產(chǎn) 生 的 抗 體 具 有 不 同 的 生 這有 利 于 基 因 工 程 苗 的 研 究 與 開 發(fā)。 羅 物學(xué)特性， 軍榮等 豬體內(nèi)評價這種疫苗的體液免疫反應(yīng)時以檢測的中 和 抗 體 水 平 為 指 標， 果 證 明 結(jié) 免疫小鼠 和 仔 豬 可 誘 導(dǎo) 產(chǎn) 生 高 水 平 的 中 和 抗體， 進 一 步 研 制 基 因 工 程 疫 苗 奠 定 了 為 基礎(chǔ)。 分析 能 誘 導(dǎo) 高 水 平 的 （ 推測可能 與 以 下 幾 方 面 的 因 素 有 關(guān)：） 中和抗體， 目的抗原 免疫將目的基因直接注射機體組織， 可以通過自然途徑 在 細 胞 中 表

13、達， 工 成 抗 原 肽 后 加 遞呈給免疫系統(tǒng)， 此途徑與病毒感染相似， 能夠更有 效地致敏淋巴細胞， 起 廣 泛 的 體 液 免 疫 和 細 胞 免 引 （） 疫應(yīng)答； 本研究采用的是基于 啟動子調(diào)控 （ 的載體， 載 體 能 夠 高 效 表 達 外 源 基 因；） 該 融 合 蛋 白 促 進 、 和 蛋 白 翻 譯 后 （ 的修飾、 運；） 具 有 良 好 的 免 疫 原 性， 轉(zhuǎn) 蛋白本身具有誘發(fā)中和 抗 體 的 能 力， 蛋 白 具 有 誘 發(fā)特 異 性 細 胞 免 疫 的 能 力， 、 和 蛋 白 的 共表達會產(chǎn)生協(xié)同作用。 作者曾嘗 試 利 用 串 聯(lián) 與 ， 但串聯(lián)失敗， 估計

14、與基因長度 太 長（ ） 關(guān)。 有 等 用 作 為 研 究 共 表 達 成功 擴 增 的 基 因， 將 其 并 分別克隆于原核表達載 截短為 和 片段， 體 在 中， 的 誘 導(dǎo) 下 進 行 重 組 蛋白的截 短 表 達， 檢 測 證 實 表 經(jīng) 達的 種截短重組蛋白均具有良好的與抗體的反應(yīng) 活性。徐明明等 利用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達 株 ， 證 明 具 有 良 好 的 免 并 疫 原 性。 左 蘭 等 成 功 構(gòu) 建 了 含 的 基因 的 真 核 表 達 質(zhì) 粒 ， 并采用 脂 質(zhì) 體 轉(zhuǎn) 染 法 將 核酸疫苗成功 轉(zhuǎn) 染 于 細 胞 中， 被 證 明 能 有 并 效表達。 等 分別以 修飾型

15、 和 構(gòu) 蛋白基因為候選基 因， 建 了 雙 基 因 共 表 達 的 真 分別免疫小鼠及斷奶仔豬， 均能誘發(fā)中 核表達質(zhì)粒， 和抗體 產(chǎn) 生 和 細 胞 免 疫 反 應(yīng)。 等 構(gòu) 建 的 真 核 表 達 質(zhì) 粒 免 疫 豬 體 也 能 刺激機體產(chǎn)生良好的細胞免疫應(yīng)答。以上研究證明 了 蛋 白 基 因 共 表 達 在 體 內(nèi) 誘 導(dǎo) 產(chǎn) 可 生病毒中和抗體的 重 要 性， 作 為 研 制 核 酸 疫苗的重要候選基因。 基于 以 上 研 究 成 果， 研 究 克 隆 了 本 、 和 基因， 利用 成 功 構(gòu) 串聯(lián) 與 得 到 ， 建 了 在 啟 動 子調(diào)控下共表達 、 和 蛋 白 的 真 核表達

16、質(zhì) 粒 。 通 過 體 外 瞬 證實 時轉(zhuǎn)染和 檢測， 疫苗重 組質(zhì)粒 轉(zhuǎn) 染 細 胞 后 而 、 和 蛋 白 可 以 同 時 共 表 達， 且 表 達 的 這 種蛋白是以融合蛋白形式表達。 中和抗體如同抵御感染和預(yù)防動物間病毒傳播 的第一道防線 和 蛋 白 獲 得 了 良 好 的 免 疫 效 果。 等 用 使重組眼鏡蛇神經(jīng)毒素在大腸桿菌 中獲得高水平 表 達。 甘 氨 酸 （ ） 脯 氨 酸 （ ） 種 和 兩 有 柔性氨基酸的結(jié)合 使 用， 利 于 表 達 蛋 白 的 空 間 結(jié) 構(gòu)的正確折疊， 利于 形 成 具 有 天 然 蛋 白 的 空 間 結(jié) 構(gòu) 和性質(zhì)， 結(jié)合是目前 設(shè) 計 中 應(yīng)

17、 用 較 多 且 效果較好的。甘氨 酸 是 相 對 分 子 質(zhì) 量 最 小、 鏈 最 側(cè) 可增加側(cè)鏈的柔性； 脯氨酸作為第二位 短的氨基酸， 氨基酸， 與大角度的旋轉(zhuǎn)有關(guān)， 因而利于肽鏈的正確 折疊。 理想的 疫苗應(yīng)該在短時間誘導(dǎo)高水 平 本 的中和抗體和特異 性 細 胞 免 疫 反 應(yīng)， 研 究 構(gòu) 建 的 共表達 、 和 融 合 蛋 白 的 真 核 表 達質(zhì)粒 能夠較好地誘發(fā)小 ， 鼠和仔豬產(chǎn)生較高的特異性針對 的中和抗 體， 雖然對豬的免疫保護性還需大量的試驗驗證， 但 為 的新型疫苗的研制提供了新的思路。 結(jié) 論 本試驗成功擴增了 株的 、 和 基 因 片 段， 次 利 用 連 接 首 。因此， 誘導(dǎo)強 的 中 和 抗 體 應(yīng) 答 將 畜牧獸醫(yī)學(xué)報 卷 首 和 基因片段； 次 成 功 構(gòu) 建 共 表 達 、 和 融 合 蛋 白 的 真 核 重 組 質(zhì) 粒 ； 鼠 和 仔 豬 免 疫 試 驗 表 明 小 從 具 有 良 好 的 免 疫 原 性， 而為 基因工程疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。 參考文獻： ， ， ， （ ） ： ， ， （ ） ， ， ， ， ， （ ） ： ， ， ， ， ， （ ） ： ， ， ： 黃培 堂，等 譯 北 京：科學(xué)出版社， 羅軍榮， 胡國良， 余群英， 株 基 等 因的克 隆、 列 分 析 及 表 達 中 國