氧化修飾高、低密度脂蛋白對(duì)膽固醇合成及逆轉(zhuǎn)運(yùn)基因SREBP-2和ABCA1表達(dá)的影響

1、氧化修飾高、低密度脂蛋白對(duì)膽固醇合成及逆轉(zhuǎn)運(yùn)基因SREBP-2和ABCA1表達(dá)的影響    動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種嚴(yán)重影響人類健康的疾病,冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病是其中危害最大的一種,特別是隨著我國(guó)老齡社會(huì)的到來,在我國(guó)冠心病(Coronary heart disease,CHD)的發(fā)病率和患病率日益增加。冠心病為多因素疾病,即多種因素作用于冠心病發(fā)病的不同環(huán)節(jié)所致。冠心病的主要危險(xiǎn)因素大體上可以分為不可改變因素(如性別、年齡、冠心病家族史等)和可改變因素或者環(huán)境因素(如血脂異常、高血壓、吸煙、糖尿病和糖耐量異常),還

2、有肥胖、少體力活動(dòng)、A型性格、感染等。其中血脂異常特別是高膽固醇已是公認(rèn)的危險(xiǎn)因素。膽固醇是生物體內(nèi)一種重要的脂類物質(zhì),它一方面是生物膜的基本成分之一,另一方面又是膽汁酸、類固醇激素等多種生理活性物質(zhì)的原料。然而膽固醇濃度異常增高及其功能狀態(tài)的改變都可以導(dǎo)致增加動(dòng)脈粥樣硬化和心臟病的危險(xiǎn),因此機(jī)體內(nèi)膽固醇的濃度及正常生物活性應(yīng)受到嚴(yán)格調(diào)控,以保證其正常生物功能發(fā)揮。大量研究表明,動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展與低密度脂蛋白(low densitylipoprotein,LDL)受到氧化修飾有關(guān)。天然的LDL中含有大量不飽和脂肪酸,容易發(fā)生自身氧化,形成氧化低密度脂蛋白(oxidized LDL,ox

3、-LDL)。近年來大量研究認(rèn)為,LDL促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展主要通過ox-LDL的作用得以實(shí)現(xiàn)。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-2(Sterol regulatory element binding proteins2,SREBP-2)是重要的核轉(zhuǎn)錄因子之一,它能與脂質(zhì)合酶基因的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合,激活靶基因轉(zhuǎn)錄,特異性調(diào)控膽固醇攝入及合成代謝。體內(nèi)脂質(zhì)代謝特別是膽固醇的穩(wěn)態(tài)依賴于SREBP-2的調(diào)節(jié)。SREBP-2基因表達(dá)異?？蓪?dǎo)致這種調(diào)節(jié)平衡失調(diào)時(shí),細(xì)胞內(nèi)膽固醇就會(huì)大量沉積,最終導(dǎo)致泡沫細(xì)胞的形成。目前研究尚無明確的關(guān)于氧化型脂蛋白對(duì)單核源性巨噬細(xì)胞中SREBP-2表達(dá)影響的研究,

4、探討氧化型脂蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞中膽固醇合成調(diào)節(jié)基因SREBP-2表達(dá)的作用有利于闡明其致動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制。本研究從氧化型脂蛋白(主要是ox-HDL和ox-LDL)對(duì)SREBP-2影響角度進(jìn)行研究,以了解氧化型脂蛋白調(diào)控巨噬細(xì)胞SREBP-2表達(dá)在致動(dòng)脈粥樣硬化過程中的作用。膽固醇的另一組分,高密度脂蛋白膽固醇亦會(huì)被氧化修飾成氧化型高密度脂蛋白(oxidized HDL,ox-HDL),當(dāng)其成為ox-HDL后即和ox-LDL一樣具有較強(qiáng)的致動(dòng)脈粥樣硬化作用,而失去其抗動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)作用。目前研究表明高密度脂蛋白對(duì)心血管系統(tǒng)具有保護(hù)作用,這種保護(hù)作用是通過細(xì)胞逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)(Reverse Cho

5、lesterol Transport,RCT)機(jī)制來實(shí)現(xiàn)的,腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體Al(ATP binding cassette transporter Al,ABCA1)是升高HDL-C及增加逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵基因,ABCA1在逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)過程中把膽固醇成分逆轉(zhuǎn)運(yùn)給HDL-C,再通過HDL-C組裝后經(jīng)血液循環(huán)到肝臟中代謝排除。由此可見,HDL和ABCA1在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)中起著關(guān)鍵性作用。已有研究表明,當(dāng)HDL被氧化修飾后則失去了這種正常生物學(xué)保護(hù)作用,且ox-HDL具有導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的作用。本研究就試圖通過建立冠心病患者外周血來源巨噬細(xì)胞模型,然后給予不同濃度ox-HDL和ox-LDL干預(yù),

6、RT-QPCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞模型ABCA1mRNA表達(dá)變化,以初步探討ox-HDL和ox-LDL調(diào)控巨噬細(xì)胞ABCA1表達(dá)在致動(dòng)脈粥樣硬化過程中的作用。目的擬通過建立冠心病外周血單核細(xì)胞來源巨噬細(xì)胞模型,予以不同濃度的ox-LDL和ox-HDL進(jìn)行干預(yù),觀察不同濃度ox-LDL和ox-HDL影響下巨噬細(xì)胞中SREBP-2及ABCA1表達(dá)的改變,以探討ox-LDL和ox-HDL在冠心病發(fā)生發(fā)展中與SREBP-2和ABCA1表達(dá)變化關(guān)系。對(duì)象與方法1、對(duì)象根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)2007年公布的不穩(wěn)定性心絞痛和非ST段抬高心肌梗死診斷與治療指南及2004年ACC/AHA公布的ST段抬高心肌梗死診斷和治療指南的

7、診斷標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)病史、心電圖、心肌酶譜、肌鈣蛋白和冠脈造影確診為冠心病的患者共50例,其中男性26例,女性24例,平均年齡(60.12±8.36)歲;選擇經(jīng)詢問病史,體檢、實(shí)驗(yàn)室檢查(血、尿、便常規(guī)、血脂、血糖、肝腎功能)、心電圖、超聲心動(dòng)圖、X線胸片及冠脈造影等檢查排除冠心病的正常對(duì)照組12例。其中男6例,女6例,年齡59.83±7.20歲。各組性別、年齡無顯著性差異(P0.05)。研究對(duì)象知情同意,試驗(yàn)方案通過倫理委員會(huì)鑒定。2、方法2.1所有入選病例均行冠狀動(dòng)脈造影檢查,根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影檢查結(jié)果并結(jié)合臨床癥狀、心電圖及心肌酶譜的變化隨機(jī)分為6組:(1)、正常對(duì)照組12例;

8、(2)、無干預(yù)冠心病組10例;(3)、40mg/L ox-LDL冠心病組10例;(4)、120mg/Lox-LDL冠心病組10例。(5)、40mg/L ox-HDL冠心病組10例;(6)、120mg/L ox-HDL冠心病組10例。嚴(yán)格登記入選病例一般資料:年齡、性別、血脂指標(biāo)等。2.2 LDL、ox-LDL、HDL和ox-HDL的制備和鑒定:首先采用密度梯度超速離心法分離LDL和HDL。然后在含10mol/L CuSO_4的PBS溶液中37氧化至顏色由橙黃色轉(zhuǎn)為乳白色(6小時(shí)),然后PBS溶液中透析純化,過濾除菌,BCA試劑蛋白定量,調(diào)蛋白濃度至1g/L。聚丙烯酰胺凝膠電泳法鑒定ox-LDL

9、和ox-HDL。2.3單核細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定:在行冠狀動(dòng)脈造影前,無菌操作下,從橈動(dòng)脈或股動(dòng)脈抽取動(dòng)脈血20ml,采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。在37,5%CO_2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)4小時(shí)后的單個(gè)核細(xì)胞,此時(shí)單核細(xì)胞貼壁,輕輕倒去上層未貼壁的淋巴細(xì)胞。收集部分單核細(xì)胞樣本進(jìn)行臺(tái)盼蘭拒染檢測(cè)細(xì)胞活力;通過單核細(xì)胞表面特異性標(biāo)志分子CD14,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)單核細(xì)胞的純度。2.4單核源性巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)和干預(yù):各組培養(yǎng)的單核細(xì)胞用含終濃度為50 ng/ml的氟波脂(PMA)刺激48小時(shí),使之大部分轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞。光學(xué)顯微鏡觀察單核-巨噬細(xì)胞。按步驟2.1隨機(jī)分組給

10、予不同濃度ox-LDL及ox-HDL干預(yù),原條件下培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育培養(yǎng)48小時(shí)。2.5孵育培養(yǎng)48小時(shí)后,收集巨噬細(xì)胞,Trizol法提取總RNA,總RNA提取產(chǎn)物采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD260/OD280比值,并用1.82%瓊脂糖凝膠電泳分析方法來確定RNA的量和純度。2.6 SREBP-2和ABCA1基因序列來自PubMed,引物設(shè)計(jì)采用Primer Premier5.0引物設(shè)計(jì)件進(jìn)行設(shè)計(jì)。熒光相對(duì)定量RT-QPCR法檢測(cè)不同試驗(yàn)組巨噬細(xì)胞中SREBP-2和ABCA1的表達(dá)變化。對(duì)其擴(kuò)增曲線進(jìn)行記錄分析,采用CT值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,采用2(-(CT)公式計(jì)算SREBP-2和ABCA1相對(duì)表

11、達(dá)水平。3、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(?)±SD)表示。計(jì)量資料多組間差異比較經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后采用單因素方差分析(one-way ANOVA);其中,滿足方差齊性的數(shù)據(jù)組間多重比較采用LSD法,不滿足方差齊性的多重比較方法采用Dunnett T3檢驗(yàn)。P0.05認(rèn)為有顯著性差異。結(jié)果1、不同組間年齡、性別、比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。冠心病組總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、LDL-C較正常對(duì)照組高,HDL-C較正常對(duì)照組低,各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P值均小于0.05。冠心病各組間TC、TG、LDL-C和HDL-C無

12、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2、成功分離出LDL和HDL,并成功制備氧化型脂蛋白。3、成功培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞來源巨噬細(xì)胞,細(xì)胞活力檢測(cè)活力大于95%。4、無干預(yù)冠心病組和正常對(duì)照組比較,巨噬細(xì)胞中SREBP-2和ABCA1 mRNA表達(dá)方面無顯著性差異。5、40mg/L ox-LDL和ox-HDL干預(yù)冠心病組中巨噬細(xì)胞SREBP-2表達(dá)分別較對(duì)照組明顯增加,具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。120mg/L ox-LDL和ox-HDL干預(yù)冠心病組中SREBP-2表達(dá)分別與對(duì)照組相比較,無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.96)。40mg/L和120mg/L ox-LDL干預(yù)冠心病組,以及40mg/L和120mg/Lo

13、x-HDL干預(yù)冠心病組間比較,巨噬細(xì)胞中SREBP-2表達(dá)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。6、40mg/L ox-LDL干預(yù)冠心病組中巨噬細(xì)胞ABCA1表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。120mg/L ox-LDL干預(yù)冠心病組中巨噬細(xì)胞ABCA1表達(dá)較對(duì)照組則明顯降低,有顯著性差異(P0.05)。40mg/L和120mg/L ox-LDL干預(yù)冠心病組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。40mg/L及120mg/L ox-HDL干預(yù)冠心病組巨噬細(xì)胞ABCA1表達(dá)較對(duì)照組明顯降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。并且兩干預(yù)組間ABCA1表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論1、脂質(zhì)代謝

14、紊亂是動(dòng)脈粥樣硬化的重要危險(xiǎn)因素。2、SREBP-2和ABCA1可能不是動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)基因,動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病是多種危險(xiǎn)因素長(zhǎng)期綜合作用的結(jié)果。3、氧化型LDL能影響SREBP-2和ABCA1 mRNA的表達(dá)。在低濃度ox-LDL干預(yù)下,SREBP-2表達(dá)有增加,這說明在動(dòng)脈粥樣硬化早期ox-LDL可通過增加巨噬細(xì)胞SREBP-2介導(dǎo)的膽固醇合成代謝聚集大量的脂質(zhì),從而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的形成與發(fā)展。高濃度的ox-LDL干預(yù)下,反而有降低SREBP-2的趨勢(shì),這可能是由于高濃度ox-LDL對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的細(xì)胞毒性以及SREBP-2的負(fù)反饋調(diào)節(jié)有關(guān)。在低濃度的ox-LDL可以上調(diào)ABC

15、A mRNA的表達(dá),這說明在動(dòng)脈粥樣硬化早期細(xì)胞內(nèi)ABCA1表達(dá)代償性的增加,從而減少異常增多的ox-LDL攝入,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)異常增多的ox-LDL排出。但是在高濃度的情況下,高濃度的ox-LDL并不能繼續(xù)上調(diào)ABCA1的表達(dá),反而對(duì)ABCA1的表達(dá)有明顯抑制作用,這可能是由于異常過高的脂質(zhì)毒性使ABCA1介導(dǎo)的膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)作用受損,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)異常脂蛋白的大量聚集,從而最終形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。4、氧化型HDL同樣對(duì)SREBP-2和ABCA1 mRNA的表達(dá)有影響。低濃度的ox-HDL刺激增加了巨噬細(xì)胞中SREBP-2的表達(dá),而抑制了ABCA1的表達(dá);這種改變一方面與動(dòng)脈粥樣硬化早期巨噬細(xì)胞對(duì)異常增加ox-HDL反應(yīng)性有關(guān),另一方面與SREBP-2激活后對(duì)ABCA1的抑制作用有關(guān),從而促進(jìn)了動(dòng)脈硬化斑塊中脂質(zhì)的聚集。但是高