補(bǔ)腎通絡(luò)中藥對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎Foxp3表達(dá)的影響

1、補(bǔ)腎通絡(luò)中藥對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎Foxp3表達(dá)的影響         08-10-30 15:29:00     作者：潘偉軍    編輯：studa20【摘要】  目的：觀察補(bǔ)腎通絡(luò)中藥對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者Foxp3表達(dá)的影響。方法：隨機(jī)選擇來我院健康體檢者30例為對(duì)照組，同時(shí)選擇我院門診類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者50例為治療組。治療組患者（初治/或經(jīng)過兩周的清除期）內(nèi)服補(bǔ)腎通絡(luò)方3個(gè)月后，提取所有受試者外周血總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA

2、后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)對(duì)照組和治療組治療前后Foxp3 mRNA的含量。結(jié)果：治療組治療前后外周血Foxp3表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組（P0.01），治療組治療后外周血Foxp3表達(dá)水平亦明顯高于治療前（P0.01）。結(jié)論：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者存在表達(dá)Foxp3的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量減少和/或功能降低，這種調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群的異?？赡軈⑴c了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病和病變進(jìn)展，補(bǔ)腎通絡(luò)中藥治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎可能是通過上調(diào)Foxp3表達(dá)而發(fā)揮作用。 【關(guān)鍵詞】  類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 補(bǔ)腎通絡(luò)中藥 Foxp3 mRNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法 2m 調(diào)節(jié)免疫功能    類

3、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種以慢性破壞性關(guān)節(jié)炎為主要特征的系統(tǒng)性自身免疫疾病。RA源于免疫平衡失調(diào)，機(jī)體通過多種機(jī)制調(diào)控自身免疫應(yīng)答，其機(jī)制十分復(fù)雜，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在免疫平衡機(jī)制方面起著重要作用，但其在RA發(fā)病機(jī)制中的作用尚不清楚。本研究對(duì)中藥治療RA后外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性標(biāo)志Foxp3進(jìn)行測(cè)定，探討Foxp3在RA發(fā)病中的意義，探討中藥調(diào)控T細(xì)胞介導(dǎo)RA適應(yīng)性免疫應(yīng)答的機(jī)制，為RA發(fā)病機(jī)制及用補(bǔ)腎通絡(luò)中藥防治RA提供理論依據(jù)。    1   資料與方法    1.1&#

4、160;  臨床資料    隨機(jī)選取來我院體檢的30例健康者作為正常對(duì)照組（對(duì)照組），同時(shí)選擇我院門診50例RA患者作為治療組。對(duì)照組中男12例，女18例；年齡最小15歲，最大57歲，平均（52.19±10.50）歲；治療組中男18例，女32例；年齡最小13歲，最大61歲，平均（51.21±11.73）歲；病程最短3年，最長15年，平均（7.5±2.6）年。所有RA病例均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)1987年的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎分類診斷標(biāo)準(zhǔn)1。    1.2   治療方法 

5、60;  治療組（初治/或經(jīng)過2 w的清除期）內(nèi)服補(bǔ)腎通絡(luò)方，藥物組成：制附子先煎12 g ，制川烏先煎12 g，淫羊藿12 g，補(bǔ)骨脂15 g，桑寄生30 g，丹參10 g，熟地黃15 g，獨(dú)活15 g，木瓜30 g，威靈仙15 g，雷公藤10 g，全蝎研末沖服3 g，烏梢蛇10 g，甘草6 g。臨床隨證加減：氣血虛者加黃芪30 g， 當(dāng)歸15 g；痛甚者加細(xì)辛3 g，制草烏先煎9 g；腫脹明顯者加萆薢9 g，生苡仁15 g；關(guān)節(jié)僵直者選加乳香、沒藥各6 g；局部有風(fēng)濕結(jié)節(jié)者加赤芍10 g，白芥子12 g。小兒酌情減量。每日1劑，早晚分服。1個(gè)月為1個(gè)療程，共治療3個(gè)月。 

6、;   1.3   實(shí)驗(yàn)方法    1.3.1  RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)   受試者禁食12 h以上，清晨空腹采取靜脈血10 mL。采用淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)笊镏破酚邢薰旧a(chǎn)）分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，利用Trizol （美國Invitrogen公司生產(chǎn)）一步法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA，取總RNA2 g進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，-80 保存。    1.3.2  Foxp3定量標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建   取上述cDNA2 L，進(jìn)行PCR

7、擴(kuò)增。Foxp3 引物（上海博亞公司合成）： 5-TCAAGCACTGCCAGGCG-3和5-CAGGAGCCCTTGTCGTCGGAT-3。將PCR產(chǎn)物插入pgM-T載體（北京天為時(shí)代公司生產(chǎn)），并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TOP10 （北京天為時(shí)代公司生產(chǎn)） ，經(jīng)藍(lán)白斑篩選獲得陽性克隆，測(cè)序鑒定目的片段插入正確。抽提質(zhì)粒，并進(jìn)行110倍比稀釋，制成107 ng/mL、106 ng/mL、105 ng/mL、104 ng/mL和103 ng/mL共5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，分裝后-20 保存。    1.3.3  外參照2m定量標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建  取上述cDNA2 L

8、，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。2m引物（上海博亞公司合成）：5-CCAGCAGCGAATGGAAACTC-3和5-GATGCTGCTTACATGTCTCG-3。余步驟同1.3.2。    1.3.4  熒光定量PCR法檢測(cè)Foxp3 mRNA相對(duì)含量   取上述cDNA1 L，使用Quant SYBR green PCR kit（美國ABI公司生產(chǎn)）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，終體積25 L。同時(shí)進(jìn)行各自標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增，每個(gè)樣本均重復(fù)3 復(fù)孔。PCR反應(yīng)條件： 50 2 min， 95 10 min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)（95 30秒， 52 30秒，72 30秒）

9、 。為了消除樣本提取、逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)過程中造成的差異，以Foxp3 mRNA 和2m mRNA 含量的比值，即Foxp3的相對(duì)表達(dá)水平，作為評(píng)價(jià)Foxp3表達(dá)水平的指標(biāo)。    1.4   統(tǒng)計(jì)學(xué)方法    結(jié)果采用SPSS 10.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間比較采用方差分析。     08-10-30 15:29:00     作者：潘偉軍    編輯：studa20  &#

10、160; 2   結(jié)   果    2.1   療效標(biāo)準(zhǔn)    參照國家中醫(yī)藥管理局1994 年發(fā)布的中醫(yī)病證診斷標(biāo)準(zhǔn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)2。痊愈： 關(guān)節(jié)疼痛腫脹消失、晨僵消除；好轉(zhuǎn)： 關(guān)節(jié)疼痛腫脹消失， 偶有痛感，晨起稍有僵硬；無效： 關(guān)節(jié)疼痛腫脹、晨僵同治療前。    2.2   療效觀察    2.1.1   補(bǔ)腎通絡(luò)中藥治療RA的療效   5

11、0例RA患者中，痊愈28例，好轉(zhuǎn)15例，無效7例，有效率86.00%。    2.2.2   補(bǔ)腎通絡(luò)中藥對(duì)外周血Foxp3基因表達(dá)水平的影響   治療組治療前Foxp3基因表達(dá)水平為（2.11±1.05），治療后為（4.39±1.78），治療前后比較有顯著性差異（P0.01）；對(duì)照組Foxp3基因表達(dá)水平為（12.62±5.37），與治療組比較有顯著性差異（P0.01）。    3   討   論  &#

12、160; 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病是由多種因素共同作用的結(jié)果，自身免疫反應(yīng)是其中的重要環(huán)節(jié)，其中Tr細(xì)胞（即調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）在免疫平衡機(jī)制方面起著重要作用。因此，立足調(diào)節(jié)T細(xì)胞探討其介導(dǎo)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制具有重要意義。新近一項(xiàng)研究證實(shí)Foxp3可以調(diào)節(jié)Tr細(xì)胞的發(fā)育和功能，為免疫調(diào)節(jié)的初始開關(guān)，在免疫調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用34。另有研究表明Foxp3在自身免疫性疾病中低表達(dá)，通過Foxp3轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，增強(qiáng)Foxp3基因表達(dá)可預(yù)防和減少這類自身免疫性疾病的發(fā)生。定量檢測(cè)Foxp3基因表達(dá)水平，可評(píng)估機(jī)體免疫平衡狀況。本研究結(jié)果提示 RA患者外周血Foxp3表達(dá)水平顯著低于健康對(duì)照組，表明RA患

13、者體內(nèi)可能存在表達(dá)Foxp3的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞減少和/或功能降低。    類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)“痹病”范疇，祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病由于先天稟賦不足、正氣虧虛，感受風(fēng)寒濕熱之邪，致使氣血運(yùn)行受阻，痰凝血瘀，痹阻于肌肉、骨節(jié)、經(jīng)絡(luò)之間，引起關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、晨僵，甚至關(guān)節(jié)變形，活動(dòng)受限，重則喪失勞動(dòng)能力。故宜益氣養(yǎng)血、補(bǔ)腎壯骨以扶正，祛風(fēng)、散寒、除濕、清熱以祛邪，兼以通絡(luò)。我們認(rèn)為腎虛是其發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，免疫紊亂是RA發(fā)生發(fā)展的根本原因。根據(jù)上述理論，我們?cè)诒宰C研究中，克服單因素致痹研究的缺陷，從腎虛入手，提出治療RA的主要原則是補(bǔ)腎通絡(luò)，據(jù)此治療原則篩選中藥組成防治RA的補(bǔ)腎

14、通絡(luò)方。該方以補(bǔ)骨脂補(bǔ)腎助陽壯骨為君藥；輔以淫羊藿、桑寄生補(bǔ)腎壯骨，熟地黃滋陰養(yǎng)血、補(bǔ)益肝腎，雷公藤祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)，制附子、制川烏祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)通絡(luò)為臣藥；配以丹參活血通絡(luò)，獨(dú)活、木瓜、烏梢蛇、全蝎、威靈仙祛濕通絡(luò)，共為佐藥；再以甘草調(diào)中和胃為使藥。諸藥合用共奏補(bǔ)腎通絡(luò)，活血祛濕之功。經(jīng)過一系列的實(shí)驗(yàn)與臨床研究表明，該方能補(bǔ)腎壯骨，增強(qiáng)自身免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)抗病能力，而且能祛濕除痹，通經(jīng)活絡(luò)止痛，且無毒副作用，是一個(gè)較理想的防治RA的中藥制劑。同時(shí)RA患者通過補(bǔ)腎通絡(luò)中藥治療后外周血Foxp3表達(dá)水平增高，表明補(bǔ)腎通絡(luò)中藥可能通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能改善RA患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的水平而發(fā)揮治療作用，其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。【參考文獻(xiàn)】  1Amett F C，Edworth S，Bllk D A，et al. The 1987 revised ARA criteriafor rheumatoid arthritisJ. Arthritis & Rheum，1987（30）：17.2國家中醫(yī)藥管理局. 中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)M. 南京：南京大學(xué)出版社，1994：29.3Wei W Z，Morris G P，Kong Y C. Anti-tumor immunity and auto- im